[发明专利]EML4‑ALK融合基因无创检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种EML4-ALK融合基因无创检测试剂盒。

背景技术

肺癌是全球发病率和致死率最高的疾病之一，其中非小细胞肺癌约占肺癌的80-85％。目前，约有10种驱动基因在肺腺癌中被发现。临床使用针对这些驱动基因的分子靶向治疗药物，使肺癌的治疗和生存期的延长取得了显著进展，因此寻找更多新的治疗靶点成为当今肺癌研究的热点。除了EGFR、KRAS等熟知的基因突变外，EML4-ALK融合基因也被证实为非小细胞肺癌的治疗靶点。EML4-ALK在非小细胞肺癌患者中的发生率约为4％～5％，并且在不伴有表皮生长因子受体EGFR突变或K-Ras突变的腺癌患者中的表达率约为42.80％。已发现的EML4-ALK融合方式有十多种，其中以V1(EML4的13号外显子断裂)、V2(EML4的20号外显子)和V3变体(EML4的6号外显子断裂)最为常见。准确鉴定出EML4-ALK融合基因的NSCLC，并给予相应的治疗是急需的。

EML4-ALK可以从肿瘤组织、CTCs或从全血中提取的mRNA中检测到，但是这些方法有实质性的限制，比如活检评估肿瘤的分子进化和异质性是具有侵入性的，而且并不总是可行，分离CTCs的成本和复杂性很高，从全血中提取mRNA具有低灵敏度的缺点。因此需要开发一种无创、简便且灵敏度高的检测方法。血浆外泌体mRNA检测融合基因突变是一种很好的方法，可以用于非侵入性的检测疾病进展。外泌体是直径在30-150nm的细胞外囊泡，能通过所有类型细胞进行分泌，并且通过内涵物将信息转运至身体的其他细胞，其内涵物包括：蛋白，脂类和核酸。外泌体在普通的生理学过程以及在疾病的发展中都发挥着作用。

目前常用于检测肺癌中ALK基因融合的技术有多种，包括免疫组织化学方法(IHC)、荧光原位杂交技术(FISH)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；此三种检测方法所使用的样本均为组织样本，为有创取样。因为使用DNA进行检测融合基因，比较繁琐，需知道内含子的具体断点才可以检测，而内含子的断点非常多且多是未知的。

数字PCR是近年来引起重视并迅速发展起来的核酸分子绝对定量技术，由于生物学研究的需要和多学科技术的交叉融合，PCR已经迈入第三代——微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)时代。ddPCR技术是一种通量较高、成本较低的绝对定量技术，可作为基因检测的初筛技术。该技术与传统方法的检测结果符合率高，方法一致性好，相比于目前主流的NGS，数字PCR在如下方面优势突出：操作快速、简便，无需复杂的生物信息学分析，检测灵敏度高。该技术基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，对微滴的荧光信号逐个分析统计。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，不再依赖ct值或内参基因即可确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。ddPCR是定量检测的一个敏感的方法，只需极少量的样本即可检测，且灵敏度高和所需样本量少，大大满足了临床珍贵样本如穿刺样本、胸腹水、外周血中靶标序列的微量检测的需求。

上述四种方法的优缺点如下表1：

表1

所以，若想通过DNA来检测融合基因的所有类型非常困难，且因使用探针较多，会导致成本较高；若有一种无创的方法获得足够的RNA，则可以减少很多成本，且可以检测的相对全面，这就成为研究的热点。

发明内容

本发明一个目的是提供用于数字PCR检测EML4-ALK融合基因突变的成套引物。

本发明提供的成套引物，包括内参上游引物EFTUD2-F1、内参下游引物EFTUD2-R1、扩增EML4-ALK融合基因的正向引物EML4(13)-ALK-F2、扩增EML4-ALK融合基因的正向引物EML4(20)-ALK-F3、扩增EML4-ALK融合基因的正向引物EML4(6)-ALK-F4、扩增EML4-ALK融合基因的反向引物EML4(6/13/20)-ALK-R、检测探针ALK-EML4(6/13/20)-TAR和内参探针EFTUD2-REF；

所述内参上游引物EFTUD2-F1的核苷酸序列为序列1；

所述内参下游引物EFTUD2-R1的核苷酸序列为序列2；

所述扩增EML4-ALK融合基因的正向引物EML4(13)-ALK-F2的核苷酸序列为序列3；