[发明专利]基于气单胞菌溶素纳米通道检测生物巯基化合物的方法

说明书

本发明基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，包括以下步骤：⑴设计连有炔基的DNA探针；⑵将巯基化合物连接到DNA探针上；⑶制备气单胞菌溶素生物纳米通道：①活化气单胞菌溶素；②配制磷脂正癸烷溶液；③制备磷脂双分子层；④形成气单胞菌溶素生物纳米通道；⑷用气单胞菌溶素检测生物巯基化合物：①采集DNA探针单分子信号；②采集物巯基化合物单分子信号；③采集DNA探针‑巯基化合物单分子信号；④对采集到的DNA探针‑巯基化合物单分子信号进行统计，得到巯基化合物特征信息，基于此对不同的巯基化合物同时进行检测。本发明的方法能在单分子水平上实现超灵敏分辨，且操作方便实时准确，对生命科学研究具有非常积极的意义。

技术领域

本发明涉及生命化学中分析检测单分子的检测技术，具体的是一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测生物巯基化合物的方法。

技术背景

生物纳米通道是现代兴起的检测核酸、多肽、糖类的一种单分子检测手段。目前应用较多的蛋白孔为葡萄球菌α-溶血素(α-hemolsyin)、耻垢分枝杆菌(MspA)。然而，由于所述蛋白孔自身孔径的限制，上述两种蛋白通道对实现DNA分子的微小分辨还存在不足。而气单胞菌溶素生物纳米通道具有更小的孔径，更高的灵敏度，且其内腔带正电荷，能有效减慢DNA的过孔速率，从而实现高通量、无标记、高灵敏、基于DNA探针的、单分子水平上的检测生物小分子技术。

生物巯基化合物——包括半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽等，在很多生理和病理学过程中发挥着极其重要的作用。所述的谷胱甘肽是最丰富的细胞内巯基化合物，在抗氧化应激、维持细胞氧化还原方面发挥着中枢作用。有研究证明：谷胱甘肽含量的变化与很多疾病有密切的关系，例如白细胞减少、牛皮癣、肝损伤、癌症和艾滋病感染等。所述半胱氨酸是参与蛋白合成、解毒和代谢的一种基本氨基酸。半胱氨酸的不足会导致生长缓慢、头发褪色、水肿、嗜睡、肝损伤、皮肤损伤等。所述同型半胱氨酸的失调与心血管疾病、老年痴呆症等密切相关。因此，对生物巯基化合物进行检测是非常重要的，它有助于解析与之相关的疾病生物学的致病机制。目前，检测生物巯基化合物的方法主要还是利用荧光探针进行检测；然而，荧光探针大都只能检测一种生物巯基化合物。要想实现对上述三种生物巯基化合物的同时检测目前还存在困难。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测生物巯基化合物的方法，该方法能在单分子水平上超灵敏分辨并同时检测三种生物巯基化合物；将生命化学中的分析检测技术提高到一个新的水平。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

基于气单胞菌溶素纳米通道检测生物巯基化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计连有炔基的DNA探针；

(2)将20μL、50～500μM、pH值为7.0～9.0的DNA探针溶液与10μL、0.5～5mM、pH值为7.0～9.0的巯基化合物溶液混合，用320～400nm紫外光照射1～4小时，利用探针上炔基与巯基化合物上巯基的加成反应，将巯基化合物连接到DNA探针上；

(3)制备气单胞菌溶素生物纳米通道

①活化气单胞菌溶素

将气单胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，在恒温箱内25℃下放置30分钟进行活化；活化后用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液进行稀释并在-20℃冰箱内保存；

②配制磷脂正癸烷溶液

在常温下将1，2-二植烷酰基磷脂溶于正癸烷溶液中，浓度为25mg/mL；

③制备磷脂双分子层

采用聚缩醛树脂检测池，所述聚缩醛树脂检测池含有cis检测池和trans检测池，在trans检测池上刻蚀直径为50nm的小孔，再用毫毛笔在所述小孔内外两侧均匀涂抹步骤(3)②配制的磷脂正癸烷溶液，用氮气吹干或让其自然晾干；