[发明专利]重组人SPINK5基因的质粒的构建方法及其应用

说明书

黑色素瘤致死率高，深入探索其发病机制，并进一步研发抑制黑色素瘤细胞增殖、侵袭等恶性行为的新治疗靶点，可为黑色素瘤临床治疗提供更充分的实验室依据。本发明的目的是，提出上皮鳞状表型相关抑制子(Lympho‑Epithelial Kazal‑type related inhibitor，LEKTI)编码基因SPINK5干扰片段的构建及其在黑色素瘤细胞增殖、侵袭方面的应用，可为黑色素瘤的基础研究及临床治疗靶点研发提供新的实验证据。其中所述的SPINK5全称为：丝氨酸肽酶抑制因子Kazal型5(Serine Peptidase InhibitorKazal Type 5,SPINK5)。

技术领域

本发明属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种上皮鳞状表型相关抑制蛋白基因SPINK5重组质粒的构建方法及其应用。

背景技术

恶性黑色素瘤死亡率高，放化疗不敏感，晚期患者5年生存率低于5％。我国黑色素瘤发病率及死亡率逐年上升，且发病年龄呈年轻化趋势。尽管分子靶向治疗药物的出现为黑色素瘤临床治疗带来突破性进展，但令人遗憾的是，CTLA-4单抗、PD-1单抗、BRAF抑制剂和MEK抑制剂等多种靶向治疗药物均未在国内上市，且价格高昂，耐药率高。因此，寻找黑色素瘤新的治疗靶点尤为重要。

SPINK5又名淋巴上皮鳞状表型相关抑制子(Lympho-Epithelial Kazal-typerelated inhibitor，LEKTI)，位于染色体5q33.1，编码分泌型丝氨酸蛋白酶抑制剂LEKTI，参与皮肤脱皮、炎症等生理病理过程，在维持皮肤正常微环境中发挥重要作用。SPINK5基因突变是先天性Netherton综合征的主要病因。然而SPINK5在皮肤黑色素瘤中的作用尚不明确。

发明内容

本发明的目的在于针对SPINK5基因在肿瘤中的研究现状及其可作为潜在治疗靶点的应用前景，提供一种表达重组人SPINK5基因的质粒及构建方法。

一种表达重组人SPINK5基因的质粒的构建方法，其包括如下步骤：

S1，从GenBank中查询SPINK5基因以及上下游的序列，设计引物。

S2，使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因

S3，用限制性内切酶分别对含有SPINK5基因的质粒和表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro(H102)载体(CutSmart)进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，回收胶

S4，用T4DNA连接酶将双酶切后的人SPINK5基因序列与双酶切后的pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体进行连接，形成重组质粒；

S5，将重组质粒进行感受态细胞转化、培养、筛选和测序验证，挑选出正确克隆的重组菌液；

S6，提取正确克隆的重组菌液中的质粒；

S7,用Western blot验证上一步中重组质粒于细胞内SPINK5蛋白的表达情况。

S8，免疫组化检测SPINK5编码蛋白在恶性黑色素瘤组织及良性色素痣组织中表达情况；

S9,MTS细胞增殖实验检测在恶性黑色素瘤细胞中利用重组质粒导入SPINK5后黑色素瘤细胞增殖能力；

S10,Transwell细胞迁移试验检测在恶性黑色素瘤细胞中利用重组质粒导入SPINK5后黑色素瘤细胞迁移能力。

优选的，所述的步骤S1中包含如下步骤：