[发明专利]一种酶促合成山奈酚的方法

说明书

本发明公开了一种酶促合成山奈酚的方法，其中涉及两种融合蛋白TrxA‑His‑F3H、TrxA‑His‑FLS1的制备及酶活性检测，并设计缓冲液体系，反应缓冲液为0.1 M Tris‑HCl（pH7.2），100μL反应体系中含有0.4%抗坏血酸、10%甘油、8.2 mMα‑酮戊二酸、0.01 mM硫酸亚铁、0.5 mM柚皮素、3.3μg TrxA‑His‑F3H、1.8μg TrxA‑His‑FLS1；并通过优化反应体系pH值、反应时间和温度，在体外建立一步高效合成山奈酚的方法。CCK‑8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种酶促合成山奈酚的方法。

背景技术

山奈酚是一种广泛存在于水果、蔬菜和中草药中的次生代谢产物——黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种生物学功能，且安全无毒，在食品和医药领域具有良好的应用前景(张雅雯等.山奈酚生物功能研究进展.生命科学,2017；29(4):400-5)。

目前，山奈酚的常用制备方法是有机溶剂提取法，然而该方法步骤繁琐复杂、周期长、得率低、成本高，需要用到大量的有机溶剂，而且原材料的来源易受到季节的限制，因而不利于工业化生产。获得山奈酚的另外一种方法是化学合成法。该方法不仅合成步骤繁琐复杂、反应条件苛刻、反应催化剂多为有毒物品、产率低，且区域选择性差、易产生大量的副产物，因而增加了分离纯化的难度和生产成本，极大地限制了山奈酚的工业化生产。

近年来，随着对黄酮类化合物生物合成途径的逐步阐明，学者们开始尝试用生物转化法在微生物体内合成黄酮类化合物，并取得了成功。如Sailesh Malla等(Malla S,etal.Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production inescherichia coli.Biotechnology and bioengineering,2013,110:2525-2535)将拟南芥的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因和黄烷酮合酶(FLS)基因以及大豆的类黄酮-3-O-糖基转移酶(UGT78K1)基因转入大肠杆菌BL21，利用大肠杆菌的内源性葡萄糖途径合成的UDPG作为糖基供体，将柚皮素进行特异性修饰，最终了合成紫云英苷。然而，采用微生物发酵法生产黄酮类化合物仍然存在很多缺点。首先，合成途径中涉及到的关键酶以及合成过程中产生的中间产物会抑制宿主菌的生长。其次，在菌体生长前期涉及到多个基因的表达，而且基因之间的协同表达缺乏一种理性的调控方式，给宿主菌带来较大的代谢负担。最后，为了提高产量，敲除大肠杆菌体内的某些代谢途径同样会影响菌体的生长。

发明内容

本发明要解决的问题：克服目前山奈酚生产方法的局限性，提供一种酶促合成山奈酚的方法，是一种在生物酶的作用下高效合成山奈酚的新方法。

本发明所采用的技术方案如下：

1.山奈酚生物合成途经中关键酶的克隆、表达和纯化

从拟南芥中克隆黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因f3h和黄烷酮合酶(FLS)基因fls1至原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h和pET-32a-fls1，按常规方法诱导表达和纯化融合蛋白。

具体包括：

一种融合蛋白TrxA-His-F3H，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

所述的融合蛋白TrxA-His-F3H的制备方法，包括以下步骤：