[发明专利]一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的LAMP检测试剂盒及检测引物

说明书

本发明公开了一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的LAMP检测试剂盒及检测引物，包括特异性引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶及荧光染料，所述特异性引物由外引物、内引物及环引物组成。本发明试剂盒特异性强，灵敏度高，操作便捷，弥补现在中华鳖养殖过程中腮腺炎高发，而病原无法确认的现状，适合中华鳖细菌性腮腺炎病的筛查与预防。

技术领域

本发明涉及中华鳖疾病检测技术领域，特别涉及一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的LAMP检测试剂盒及检测引物。

背景技术

中华鳖是一种名贵、经济价值很高的水生动物。在动物分类上，中华鳖属脊索动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳖科（Trionychidae)。鳖科现有7属23种，我国仅有2属3种，其中鳖属有两个种，即中华鳖(Chinese soft-shelled turtle,Pelodiscus sinensis)和山瑞鳖（Palea steindachneri），其中以中华鳖最为常见。20世纪60年代日本开始进行中华鳖的人工养殖，我国的台湾、泰国等地随日本之后开始发展中华鳖的人工养殖，中国大陆大约于上世纪70年代中后期开始进行中华鳖工厂化人工养殖。随着我国人民生活水平的日益提高，对鳖的市场需求稳步增长，中华鳖养殖从90年代初期至中期进入了高速发展期。养殖技术也由集约化程度较低的池塘养殖转化为集约化程度较高的室内控温温室养殖，养殖密度大大提高。产量也从1993年的4427吨增长到1996年的32004吨，四年间增长了7倍。随后，我国中华鳖的养殖进入了平稳发展阶段。养殖模式逐渐发展为控温高密度室内养殖结合池塘高密度养殖、池塘鱼鳖混养、池塘鳖和其他水产养殖动物等仿生态养殖。

尽管中华鳖规模化养殖得到了迅猛发展，但品种退化、病害严重以及基础研究薄弱等问题严重影响中华鳖健康养殖的可持续发展。中华鳖病害防治是中华鳖养殖过程中的关键环节之一，它直接关系到养殖者的经济效益。范红结(2001)等从患病的中华鳖中分离到雷氏普罗威登菌，可引起中华鳖的败血症，并造成肺脏、脾脏等内脏广泛形成干酪样结节；孙红祥和舒妙安(2002)从从患“穿孔病”、“腐皮病”、“溶血性腹水病”等濒死鳖的肝、心血和腹水中分离到20株细菌； 沈锦玉（2007)等从从患白底板病的中华鳖分离到嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌；Li(2008)等从患“白斑病”的中华鳖中成功分离到淡紫拟青霉；张奇亚(1996)等首次从有典型症状、濒于死亡的患病病鳖样品检测到呈球形、大小直径约为30nm的病毒样粒子；Chen(1999)等从患“红脖子”病的中华鳖分离到了直径120-160 nm的鳖虹彩病毒；刘莉（2015）等从患“出血症”病的中华鳖中分离到了直径约100nm的RNA病毒。然而，由于中华鳖生物学相关的基础研究工作相对滞后，加上养殖环境因子的复杂性，以及病原的多样性，导致很多病因只能归结于条件性致病，无法对引起中华鳖发病的致病机制进行判定，进而也无法采取有效的措施来进行防治。

鉴于此，本研究针对目前中华鳖产业中危害严重的“腮腺炎”病症，通过细菌学、病毒学的方法，结合养殖水环境的多种水质指标、菌群等因素的变化情况展开了系统性研究，初步确定了中华鳖细菌性“腮腺炎”的病因及其发病机制，确定一种腮腺炎病症的主要致病因子是一种芽孢杆菌，对中华鳖具有高致死性。针对这种代表性条件性致病菌-高致死性蜡样芽孢杆菌，建立一种快速诊断技术，满足对水体与养殖期中华鳖的检测需要，以期阻断病原的传播，对早期预防起到预警效应。

而LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术（LAMP）的原理，针对靶基因的特定区域设计特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶作用下进行恒温扩增，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测可以通过荧光染料观察的方法，具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。目前，该技术在中华鳖细菌性腮腺炎的诊断中未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的LAMP检测试剂盒，将环介导等温扩增技术与荧光染料相结合，能够快速便捷的检测中华鳖细菌性腮腺炎病原菌。