[发明专利]马蔺金属硫蛋白基因IlMT2c及其植物表达载体和构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及马蔺金属硫蛋白基因IlMT2c及其植物表达载体和构建方法。

背景技术

马蔺（Iris lactea var. chinensis）是鸢尾科鸢尾属多年生草本宿根植物，具较高观赏、药用、饲用和工业价值，在我国分布广泛。马蔺根系发达，具抗旱性、耐盐碱性、耐践踏性等优良特性^[1]。同时，马蔺的重金属修复能力强，与现有重金属修复植物相比，具有生长速度快、生物量大、适应性广等独特的生态学特征^[2]。

金属硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一类普遍存在于动物、植物和原核生物中的蛋白质。MTs含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子。根据氨基酸序列中Cys残基的排列方式和位置等，植物的MTs可以分为4大类。拟南芥AtMT2a^[3]、巴西橡胶树HbMT2^[4]、芥菜BjMT2^[5]等基因的表达均被发现与植物金属抗性相关。目前发现马蔺IlMT2家族两个成员与Cd、Cu抗性相关，IlMT2c是马蔺IlMT2家族新的成员，目前还未见报道。

科技部转基因专项共育成新型转基因抗虫棉新品种124个，累计推广3.7亿亩，减少农药使用37万吨。克隆具有自主知识产权和育种价值的新基因对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。以IlMT2c基因克隆及功能验证为基础，构建IlMT2c基因植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有抗重金属的新种质。

发明内容

本发明提供一个新的植物金属硫蛋白基因IlMT2c。

本发明还提供该植物金属硫蛋白基因IlMT2c的植物表达载体及其构建方法。

本发明的技术问题可以通过以下技术方案解决：

马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c，该基因的序列为SEQ ID NO. 1。

马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c的植物表达载体，由所述的马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c与植物表达载体构成。

所述的马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c的植物表达载体优选先将经BamH I和KpnI双酶切的马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c插入到植物表达载体pCAMBIA1301-220得到的。

所述的马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

（1）设计引物IlMT-ZF和IlMT-ZR，以马蔺cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，扩增上游引物和下游引物分别引入BamH I和KpnI酶切位点，其中上游引物IlMT-ZF序列为SEQ ID NO. 2，下游引物IlMT-ZR序列为SEQ ID NO. 3；

（2）将步骤（1）的PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-IlMT2c；

（3）利用BamH I和KpnI对pMD19-T Simple- IlMT2c和植物表达载体pCAMBIA1301-220分别进行双酶切，连接经BamH I和KpnI双酶切的pMD19-T Simple- IlMT2c得到的IlMT2c片段与双酶切pCAMBIA1301-220得到的大片段，转化TOP10感受态细胞，阳性质粒即为马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c植物表达载体pCAMBIA1301-220- IlMT2c。

所述的马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c在提高植物的耐重金属性中的应用。

所述的马蔺植物金属硫蛋白基因IlMT2c的植物表达载体在提高植物的耐重金属性中的应用。