[发明专利]用于急性过敏反应豚鼠的血清代谢生物标志物

说明书

技术领域

本发明属于分析化学和生物化学技术领域，具体涉及用于急性过敏反应豚鼠的血清代谢生物标志物。

背景技术

过敏反应归属B型不良反应范畴，是一种与正常药理作用完全无关，受免疫调控的超敏反应，难以预测，发生率低，但死亡率高，约占总药物不良反应的5％～10％。通常所说的过敏反应大多指速发型过敏反应/Ⅰ型过敏反应，是当己免疫机体再次接受相同变应原刺激时所产生的强烈的机体反应，通常由免疫原性的大分子物质或可与大分子载体结合的半抗原小分子物质引起。过敏原可刺激机体淋巴细胞产生lgE抗体，经循环系统与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的IgE Fc受体(FcεRⅠ)高亲和力结合，当相同过敏原再次进入致敏机体，与IgE结合后导致FcεRⅠ偶联而引发肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒释放过敏介质，引发局部或全身反应。

尽管药品出产前均需按照新药注册管理办法和相关的临床前安全性评价指南进行了致敏性检测，但是仍有不少在过敏实验中呈阴性的品种，投放临床后却出现了较多的过敏反应，甚至发生过敏性休克或死亡。反之，对部分已在临床上引起过敏反应的产品进行过敏实验研究，却未得出阳性结果。这说明现行的致敏性评价模型用于中药注射剂致敏性评价尚存在一定的缺陷。目前各国采用的现行药品过敏反应检查方法，主要包括豚鼠主动全身过敏试验(ASA)和大鼠被动皮肤过敏试验(PCA)。以豚鼠主动全身过敏试验为例，该方法仅仅以观察豚鼠的体征症状来判断产品是否具有致敏性，观察指标单一、观察方法简单，主观性强、灵敏度不高。鉴于后基因时代出现的又一新型组学技术—代谢组学在毒理学评价中的独特优势，若结合此方法研究药物过敏，以其高通量、全景式的定性、定量分析平台能有效的提高检测的灵敏度和特异性，有助于寻找更加敏感的表征急性过敏反应的生物标志物。

发明内容

本发明的目的在于克服传统的急性过敏反应检测方法主观性强、灵敏度低等缺点，提出基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用平台的一组用于急性过敏反应豚鼠的血清代谢生物标志物，具有客观、灵敏、可靠等特点。

本发明所述用于急性过敏反应豚鼠的血清代谢生物标志物为包括lysoPC(16:0)、 lysoPC(18:2)和lysoPC(18:0)在内的溶血磷脂酰胆碱类物质。

上述溶血磷脂酰胆碱类物质通过如下步骤寻找和分析：

(1)进行动物致敏实验并采集血清样本；

(2)将血清样本加入超高效液相色谱仪-四级杆飞行时间串联质谱仪进行检测，得到代谢指纹图谱；

(3)在MassLynx V4.1工作站中，采用MarkerLynx XS(SCN 678)软件对由 UPLC-QTof/MS检测所得代谢指纹图谱中的原始数据(原始色谱峰)进行峰检测和峰匹配，提取由代谢物碎片的保留时间、质量数和相应的峰强度/峰面积组成的数据矩阵；

(4)预处理的数据集采用Pareto标度法后导入EZinfo软件进行多元统计分析。数据的多元统计分析采用无监督的模式识别方法(如主成分分析，PCA)及有监督的模式识别方法(如偏最小二乘-判别分析，PLS-DA和正交校正-偏最小二乘-判别分析，OSC-PLS-DA)。分析结果以二维或三维得分图(scores plot)和载荷图(loadings plot)表示。根据变量投影重要性(variable importance in projection，VIP)值和相关系数绝对值(|p(corr)|) 对影响较大的变量进行筛选，使用Masslynx软件中的i-FIT功能，计算可能的分子式，以此作为候选标志物。然后再利用HMDB、KEGG、METLIN等专业数据库进一步鉴定可能的潜在生物标记物信息，结合MS/MS图谱推测其结构。

其中，步骤(1)所述动物为豚鼠；

步骤(1)中动物致敏实验及血清样本采集的具体步骤为(动物致敏方案是在2010版药典附录中“过敏反应检查法”的基础上对致敏剂量进行筛选后确定的方案；采血手段是经预实验后确定的眼眶采血)：