[发明专利]一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法。

背景技术

中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)主要有两大类细胞，神经元和神经胶质细胞，神经胶质细胞又分为大神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞)和小神经胶质细胞。神经元和大神经胶质细胞来源于外胚层，而大约占神经胶质细胞的5-20％的小神经胶质细胞被认为来源于骨髓。人们一直以来都认为哺乳动物的CNS是属于不能再生类的组织，但是，这一神经学的经典法则正受到挑战，近年的研究已经显示神经祖细胞具有在CNS进行细胞分裂的能力。虽然这些细胞的功能和寿命还有待研究，但是已有明确的证据显示，在哺乳动物的齿状回和嗅球有成熟的神经形成。近来，随着神经细胞群的分化研究，在脊髓区也同样发现有成熟的神经形成。

中枢神经系统退行性疾病，遗传性疾病等是临床上治疗的难点。由于药物治疗仅仅是对症治疗，故神经组织移植替代治疗就成为最有发展前景的方法。神经元是神经系统的结构和功能单位。神经元有接受、整合和传递信息的功能。一般就长轴突神经元而言，树突和胞体接受从其他神经元传来的信息，并进行整合，然后通过轴突将信息传递给另一些神经元或效应器。神经干细胞(neural stemcells，NSCs)定向分化为的神经元在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。因此，寻求一种可以使NSCs定向分化为神经元的方法是国内外学者的研究热点。但是NSCs的来源和数量有限是目前存在的主要问题。

相关研究已经证实骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cell，BMSCs)是最具有多向分化潜能和高度自我复制能力的细胞。BMSCs不仅能分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和造血支持细胞，还可分化为CNS细胞，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。BMSCs是一群存在于骨髓中的非造血干细胞。自体骨髓间充质干细胞，因具有无免疫排斥反应，取材方便，对供体损伤小，易于分离培养及体外增殖能力强的特点，因此，可为中枢神经系统疾病临床治疗提供丰富的细胞资源。

目前诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化的方法，诱导出的神经元比例少，大部分分化成胶质细胞。因此，急需提供一种能够提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基及培养方法。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法，可显著提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导率。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg11-8mg/L、三七多糖0.3-0.8mg/L、维生素C 5-12mg/L、EGF2-10μg/L、葡萄籽提取物2-5mg/L，神经元培养上清液补足。

进一步地，一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg16mg/L、三七多糖0.5mg/L、维生素C 7mg/L、EGF 8μg/L、葡萄籽提取物4mg/L，神经元培养上清液补足。

进一步地，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣3-5倍重量的水，煮40-60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加2-4倍重量的水，煮30-50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入2-3倍水，煮20-30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/4-1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。

进一步地，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：

(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10-12天，然后真空干燥至含水量≤7％；

(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60-62℃，萃取压力为3.8-4.0MPa，萃取时间为1-1.5h，得萃取物；

(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。

进一步地，神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养3-5h，换液，继续培养3-5天，得神经元培养上清液。