[发明专利]用于鉴定苹果异胫小卷蛾的特异性引物及PCR检测方法和试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于鉴定苹果异胫小卷蛾的特异性引物，包括如上游引物ThL‑Its319F和下游引物ThL‑Its732R。还公开了具有用于鉴定苹果异胫小卷蛾的试剂盒及其检测方法，包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、ddH₂O和上述的特异性引物对ThL‑Its319F、ThL‑Its732R。该特异性引物和试剂盒建立的常规PCR具有快速、灵敏和准确等优点，适用于苹果异胫小卷蛾不同虫态的检测，为我国苹果异胫小卷蛾在分子水平上的分类和近似种的快速鉴定奠定了基础。研究结果可直接应用于进境水果中截获的苹果异胫小卷蛾的检疫鉴定，对保护我国农林生产安全、维持生态平衡都有极为重要的意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。

背景技术

苹果异胫小卷蛾Thaumatotibia leucotreta(Meyrick,1913)异名苹果异形小卷蛾Cryptophlebia leucotreta，隶属鳞翅目Lepidoptera,卷蛾科Tortricidae,小食心虫族Gapholitini,异胫小卷蛾属Thaumatotibia，为我国进境植物检疫性有害生物，该虫为杂食性害虫，主要寄主有鳄梨Persea americana、柑橘Citrus spp.、桃Prunus persica、番石榴Psidium guajava、芒果Mangifera sp.、玉米Zea mays、棉花Gossypium herbaceum、澳大利亚坚果Macadamia spp.、金合欢Acacia spp.、栎木Quercus spp.、番樱桃Eugenia spp.、甘蔗Saccharum officinarum、荔枝Litchi chinensis、茄子Solanum melongena、茶Camelliasinensis、辣椒Capsicum spp.等30科70多种植物，是具有重要经济意义害虫。

该虫与坚果异胫小卷蛾Thaumatotibia batrachopa、苹果蠹蛾Cydia pomonella、梨小食心虫Grapholita molesta等卷蛾在形态和寄主植物上较为相似，仅凭成虫的外部形态特征往往难于做出快速准确的鉴定。近年来，我国从南非进口的西柚、柑橘、葡萄等水果中多次截获该虫。在国外，该虫也常有截获报道，如Mazza(2014)报道意大利口岸首次截获苹果异胫小卷蛾，果实被危害率高达2％；Gilligan(2011)报告在美国加州首次发现该虫；在丹麦、芬兰、瑞典和英国等口岸偶尔有截获该虫的报道。

目前针对苹果异胫小卷蛾的检测鉴定主要依据成虫外部形态特征和DNA条形码序列进行鉴定。由于进口水果上截获的通常为幼虫，通过其外部形态特征往往难以鉴定，此时必须借助于分子生物学方法来鉴定。目前采用的分子鉴定方法主要通过测定其线粒体细胞色素氧化酶第一亚基基因(COI)片段序列，将测序结果导入数据库中进行比对分析来鉴定，然而该方法所需的时间相对较长(需2～3天)。

发明内容

为了满足进口水果的快速通关需求，本发明提供了一种用于鉴定苹果异胫小卷蛾的特异性引物及PCR检测方法和试剂盒，该特异性引物筛选自苹果异胫小卷蛾及其近似种类的编码核糖体RNA的基因(rDNA-ITS)。

编码核糖体RNA的基因(rDNA)是真核生物中最为保守的结构基因，它以衔接重复的方式排列，每一个重复包括三个编码区(分别编码18S，5.8S和28S RNA基因)，编码区之间被两个ITS(Internal Transcribed Spacers)所分隔，重复之间分别被一个ETS(ExternalTranscribed Spacer)和一个IGS(Integenic Spacer)所分隔，由于rDNA在基因组内有数百个拷贝(增加了检测的灵敏度)和ITS及IGS区域在种内的稳定性及种间的差异，使其成为许多生物遗传变异研究的重要对象。

本发明所采取的技术方案是筛选了苹果异胫小卷蛾及其近似种类的编码核糖体RNA的基因(rDNA-ITS)的特异性引物，建立了该虫的快速分子PCR检测鉴定方法：