[发明专利]羊边界病毒抗体检测ELISA试剂盒

说明书

本发明公开了一种羊边界病病毒重组E0蛋白、E0蛋白在检测羊边界病毒抗体方面的应用及一种检测羊边界病毒抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒含有BDV重组E0蛋白作为抗原包被的ELISA板。E0重组蛋白系将包含E0主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体pET‑32a(+)得到重组表达载体，具体来说，通过以下方法获得：根据BDV‑E0基因序列,设计一对特异引物,然后通过RT‑PCR方法对BDV的E0基因进行扩增，将E0基因定向插入到pET‑32a(+)表达载体，筛选获得阳性重组表达质粒pET‑32a(+)‑BDV‑E0，并将该质粒转化置BL21感受态细胞，再经ITPG诱导表达，获得BDV‑E0重组蛋白。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种羊边界病毒重组E0蛋白和羊边界病毒抗体的ElISA试剂盒及检测方法。

背景技术

羊边界病毒(Border disease virus；BDV)因首先发现于英格兰和威尔士的边界地区而得此名，又称羔羊被毛颤抖病(Hairy shaker disease of lambs)，是由边界病病毒引起新生羔羊以身体多毛，生长不良和神经异常为主要特征的一种先天性传染病。边界病病毒有免疫抑制作用，怀孕期感染边界病病毒后，无论胎儿是否具有免疫应答能力，病毒均可在体内的各种组织中持续存在而成为病毒的携带者和疾病的传染源。被感染的羔羊在生长成熟后的几年内，仍具有对其后代的感染性，子宫和卵巢或睾丸生殖细胞中存在的病毒，可经胎盘和精液发生垂直传播。感染了边界病病毒的成年羊主要表现为繁殖力下降和流产,羔羊表现为发育不良和畸形，多见断奶羊死亡。

边界病的发现距今已有50多年，然在国内却鲜见关于BDV的研究报道。自2013年李文良等人成功从持续性腹泻山羊病例中分离出BDV，首次证实了边界病在我国的存在。然而多数羊群发生BDV感染，或无明显临床症状，或为持续性感染。目前，我国绵羊与山羊分散饲养的养殖小户广泛存在，但普遍对羊群BDV感染缺乏认识，也没有有效的检测手段。因此，针对国内BDV分离株展开相关研究，建立简便、有效的临床检测方法，对于国内边界病的有效防控具有重要意义。

目前国际普遍采用的边界病病毒抗体的检测方法主要基于全病毒建立间接ELISA方法和中和实验，国内尚无研究报道，此外对于该蛋白诱导IgG抗体产生规律的研究尚未进行。目前市面上所用的瑞典svanova公司的试剂盒为病毒包被，病毒生产成本高，全病毒纯化难度大，难于做到纯度很高，从而造成本底高，肉眼不易区分阴阳性，再者，受疫苗免疫影响，从而造成误判。因此有必要研究一种易于纯化、成本低、具有很高的特异性和敏感性的BDV试剂盒及检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺陷，公开了一种羊边界病病毒重组E0蛋白、E0蛋白在检测羊边界病毒抗体方面的应用及一种检测羊边界病毒抗体的ELISA试剂盒。羊边界病毒E0蛋白具有9个糖基化位点，其糖基化程度很高，无膜错定位点,缺乏疏水性序列,并且还具备一定的RNase活性,但这种RNase活性在同属病毒的感染增殖、致病过程中所起的作用还尚需研究。在该病毒的结构蛋白中，E0蛋白属于保守性很高的蛋白，具备一定的免疫原性。截取位于羊边界病病毒基因组中第951bp-1870bp的碱基为E0序列，E0蛋白是由E0序列编码的。此段序列具有较好的免疫原性,无跨膜区及疏水性区域，E0蛋白能够通过构建ELISA试剂盒应用于检测羊边界病毒抗体。

该试剂盒含有BDV重组E0蛋白作为抗原包被的ELISA板。E0重组蛋白系将包含E0主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)得到重组表达载体，具体来说，通过以下方法获得：根据BDV-E0基因序列,设计一对特异引物,然后通过RT-PCR方法对BDV的E0基因进行扩增,将E0基因定向插入到pET-32a(+)表达载体,筛选获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-BDV-E0,并将该质粒转化置BL21感受态细胞,再经ITPG诱导表达,获得BDV-E0重组蛋白。该试剂盒适合批量样品的检测,大大提高了羊边界病毒血清学诊断的效率。

本发明相对于现有技术具有如下的有益效果：