[发明专利]一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用

说明书

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用，能够特异性结合143B的核酸适配体序列LP4：5’‑ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCG GCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT‑3’。本发明所述核酸适配体具有高特异性、高亲和力、可体外合成及修饰、化学性质稳定、药代动力学性质佳、无免疫原性等特点，在研究骨肉瘤转移的转移性肿瘤标志物、转移性骨肉瘤的靶向诊断和治疗方面，以及在制备骨肉瘤转移的诊断试剂、治疗骨肉瘤转移的药物等方面具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属细胞生物技术领域，具体涉及一种人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术

肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特性之一,也是肿瘤治疗失败的最根本原因。大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移。骨肉瘤（Osteosarcoma）是青少年中最常见的原发于骨的恶性肿瘤，具有很高的全身转移倾向，大约20%的患者在初次诊断时已经发生肺转移，另外还有40%的患者晚期发生远处器官转移。目前，针对骨肉瘤的主要治疗措施是截肢以及手术前后的化疗、关键部位的放疗等，但无论是原发性骨肉瘤还是转移性骨肉瘤，对常规的化疗药物都具有耐药性，肿瘤耐药是骨肉瘤患者保肢手术治疗失败及发生转移的主要原因，而肿瘤发生转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。因此，准确地对骨肉瘤及其转移做出早期诊断和有效的抑制，并探求骨肉瘤特异性肿瘤标志物和特异性治疗靶点已经成为骨肉瘤治疗的关键。

核酸适配体是一类有20～100个碱基的单链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以其适宜的空间三维结构特异性识别靶标分子，并与之结合。近年来，核酸适配体以其尺寸小、稳定性高、成本低、易修饰、与靶标亲和力高，特异性好，以及其成产简单，不需要活体或者细胞，可以体外人工合成等优势，在生物医学、生物化学等领域取得了突飞猛进的进展，成为肿瘤研究的一个有效的手段，在未来生物研究领域将有不可估量的发展空间。因此，找到特异性识别人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体，在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

利用Cell-SELEX技术，以低转移性骨肉瘤细胞株U-2 OS和正常骨细胞株hFOB1.19作为反筛细胞，以高转移性骨肉瘤细胞株143B作为正筛细胞，从体外合成的随机寡聚DNA文库（5’- ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’）中，筛选出与高转移性骨肉瘤细胞株143B特异性结合的核酸适配体。筛选中引物序列为F-primer：5’-FAM-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’,R-primer：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’,用来扩增。

具体方法如下：

(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：5’- ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；

(2)反筛：将步骤(1)准备的文库与低转移性骨肉瘤细胞株U–2OS和正常骨细胞株hFOB1.19共同孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；

(3)正筛：将步骤(2)所得的上清与高转移性骨肉瘤细胞株143B孵育，孵育完成后，洗涤143B细胞，并将143B细胞刮下来，转移至EP管中进行加热变性，之后离心分离，收集上清；

(4)PCR富集：将步骤(3)所得的上清液进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中，PCR扩增所用的引物为:

引物F：5’- ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’，