[发明专利]对虾偷死野田村病毒（CMNV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种对虾偷死野田村病毒（CMNV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到100fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉 及一种对虾偷死野田村病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

对虾偷死病(Covert mortality disease,CMD)是由“偷死野田村病毒(Covertmortality nodavirus,CMNV)”引起的一种病毒性疾病。CMNV属于野田村病毒 科α野田村病毒属(Nadaviridae,Alphanodavirus)，是一种单链RNA病毒，病 毒粒子为球形(二十面体)，无囊膜，直径32纳米。CMD是近年来我国养殖对 虾中出险的一种新发病害。2003年或更早的时候，该病在海南、广西等地高密 度养殖的凡纳滨对虾中出现，2008-2009年我国南方各省市的养殖对虾中大规模 爆发，2010年后开始传播到我国山东、河北和天津等地。分子流行病学调查显 示，凡纳滨对虾、中国对虾、日本对虾、斑节对虾、脊尾白虾、罗氏沼虾和梭子蟹中均能检出CMNV阳性，这说明CMNV不仅能够感染目前我国养殖对虾的主 要经济种类，还能感染其他甲壳类动物，由此可见CMNV宿主范围可能非常广 泛。

目前对CMNV引起的对虾病害尚无有效的治疗方法，只能以预防为主；而 这又主要依赖于早期快速的诊断和筛查。近年来基于临床组织病理学、免疫学以 及PCR技术等的各种诊断方法已被用于CMNV的检测。但是现有的这些方法 都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵 敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批 标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着 该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由 于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不 适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测 技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。 但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中 的应用还不多。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原 检测中的应用还是比较局限。本发明建立了RAA恒温荧光来检测虾桃拉病毒的 方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进 中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌 或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形 成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在 单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA 解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指 数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在 RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过 程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因 为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用 于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供对虾偷死野田村病毒(CMNV)的RAA恒 温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：