[发明专利]一种尿液保存试剂及其应用

说明书

技术领域

本申请涉及尿液保存领域，特别是涉及一种尿液保存试剂及其应用。

背景技术

尿液经一系列组织(如膀胱)排出体外，其中存在着相关组织的脱落细胞及游离DNA。尿液是人体排出的一种成分复杂的代谢废弃物，包含各种有机、无机类代谢产物；很多病理性代谢产物还包括蛋白类、糖类物质等；部分病人存在极其严重的血尿现象。同时，尿液成分的复杂性使得许多微生物能够在其中快速繁衍，加上尿液本身的特点，使得其中的核酸极易发生降解。

临床上主要使用病灶组织、细胞来对肿瘤患者进行检测、监测等，其弊端在于组织的异质性、对病人的创伤性、取样的难度等。随着测序技术的发展，血液游离DNA(Cell free DNA,cfDNA)或循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)越来越多的被用来进行癌症的早期筛查、靶向诊断、预后评估等。相关文献报道表明，尿液当中也存在游离DNA，并且其核酸突变情况可以有效预测患癌风险及预后评估，如膀胱癌等。

但是，尿液中的游离DNA含量很低，并且，在尿液环境下容易降解，与此同时，尿液中的白细胞破碎会释放大量的基因组DNA。这使得，一方面，提取的尿液核酸中游离DNA的含量极低，游离DNA大量降解而达不到检测水平；另一方面，大量的基因组DNA背景，影响检测结果的准确性。

因此，亟需研发一种尿液保存试剂，一方面能有效阻止尿液核酸降解，另一方面，又能够固定白细胞阻止其中的基因组DNA释放影响游离DNA检测。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的尿液保存试剂及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种尿液保存试剂，包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；核酸缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为7-8；金属离子螯合剂为EDTA；防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲中的至少一种；甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸中的至少一种。其中，EDTA即乙二胺四乙酸。

需要说明的是，本申请的尿液保存试剂，不仅可以对尿液中的游离DNA进行保护，防止其降解；而且，可以有效的阻止尿液中的细胞破碎，减小了因细胞破碎造成的基因组DNA背景。其中，核酸缓冲液为游离DNA提供了基础的存储环境，避免其自行降解；金属离子螯合剂则对尿液中的金属离子进行螯合，从而抑制尿液中各种酶的活性，维持尿液中的白细胞或其它脱落细胞的稳定性，同时，防止游离DNA被核酸酶降解；防腐剂同时具有抗凝血的作用，保障血细胞不致破裂，维持其稳定性；细胞固定剂用于固定尿液中的细胞，使得细胞维持自身形态结构，避免其核酸被释放出来；甲醛淬灭剂主要是与游离的甲醛反应，淬灭游离甲醛，避免其对游离DNA造成损伤，甲醛淬灭剂使得尿液中的游离DNA能够维持自身的结构稳定、保持生物学性能。以上各组分相互配合，起到保护游离DNA和避免细胞破碎释放基因组DNA的目的。本申请的尿液保存试剂能够将尿液在4℃的环境下保存至少10天，而其中的游离DNA不发生明显降解；在-20℃或-80℃下可以长期保存。不过，需要注意的是，如果需要-20℃或-80℃长期保存，应尽量避免反复冻融。

还需要说明的是，核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂各组分的用量，按照各组分的常规有效化学剂量使用即可，但是，在本申请的优选方案中，对各组分用量进行了特别限定，以达到更好的尿液中游离DNA的保存效果，详见以下方案。其中，常规有效化学剂量是指化学试剂能够正常发挥其理化功能的剂量，排除一些极端的浓度或用量情况。

优选的，Tris-HCl的浓度为1.25-2mmol/L。

优选的，EDTA的浓度为5-15mmol/L。

优选的，柠檬酸的浓度为1-1.50mmol/L，柠檬酸钠的浓度为3.25-4.0mmol/L。

更优选的，防腐剂同时采用柠檬酸和柠檬酸钠。

优选的，细胞固定剂的浓度为重量份0.05％-0.1％。

更优选的，细胞固定剂同时采用多聚甲醛、重氮烷基脲和咪唑烷基脲。

优选的，甲醛淬灭剂的浓度为20-40mmol/L。

更优选的，甲醛淬灭剂同时采用甘氨酸、赖氨酸和乙二胺。

本申请的另一面公开了本申请的尿液保存试剂在尿液或体液的保存中的应用。