[发明专利]一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用

说明书

本发明公开了一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过染色体步移技术获得GliG基因的上游启动子序列并进行启动子核心区域预测，获得埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。本发明的启动子能够高效启动潮霉素抗性基因hph的表达，且启动效率显著高于pgpdA启动子，从而为后期通过转录调控和异源表达以提高胶霉毒素产量并获得更多高活性的新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。

背景技术：

埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110是从深海中分离得到的真菌。从中分离得到了具有很强抗肿瘤及降血压活性的新型化合物胶霉毒素，从埃德菌FS110中共获得胶霉毒素15种，其中8种为新型胶霉毒素。胶霉毒素具有抗肿瘤、抗真菌活性、抗病毒和免疫调节活性，因此在抗肿瘤、抗肝纤维化、抗病毒及免疫抑制剂药物开发方面具有良好的开发前景。

启动子作为结构基因和功能基因转录调控的必要元件，能够募集转录因子与RNA聚合酶精确的起始转录。近年来，由于丝状真菌在新型、高活性次级代谢产物的发掘以及活性酶的研究和开发方面发展迅速，且丝状真菌中启动子对其内源基因的转录活性较高，因此很多不同种属丝状真菌的启动子相继被发掘，如里氏木霉(Trichoderma reesei)的cbh1、tef1启动子，gpdA启动子，木霉属(Trichoderma sp.)pki1启动子，曲霉属的glaA启动子等。但目前深海真菌次级代谢产物生物合成基因的启动子尚未被发掘。烟曲霉中胶霉毒素的生物合成基因簇已经被报道，而且已经证实GliG是胶霉毒素生物合成的关键基因(Dolan SK,O'Keeffe G,Jones GW,et al.Resistance is not futile:gliotoxinbiosynthesis,functionality and utility[J].Trends in Microbiology,2015,23(7):419-428)。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。

所述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子GliGP通过以下方法获得的：通过转录组测序获得编码谷胱甘肽硫转移酶的胶霉毒素生物合成基因GliG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在其上游序列中设计特异性反向引物sp1、sp2和sp3，采用Genome walking试剂盒的通用正向引物AP3进行三轮巢式PCR扩增，每一轮扩增产物稀释后作为下一轮扩增的模板。最后一轮的扩增产物进行TA克隆，转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆，菌液PCR验证阳性克隆并测序，获得目的基因GliG上游启动子序列，并利用启动子预测软件分析上游启动子序列，获得GliG启动子核心区域GliGP(即埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)。