[发明专利]一种高纯度D‑阿洛酮糖的制备方法

权利要求书

1.一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005经发酵培养基发酵培养，制得发酵液，发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；

所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2；

(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:(1～5)(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比20％～60％的比例加入到质量浓度为1％～3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时；

(c)配制质量浓度为20％～80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％～0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；

(d)收集步骤(c)制得的混合液，经脱色、过滤、离交得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液；

(e)步骤(d)制得的D-阿洛酮糖溶液经过色谱分离、浓缩、结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的保藏编号为CGMCC No.13152。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH6.8～7.2。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，发酵培养步骤如下：

按照体积百分比1～2％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.04～0.06Mpa，通风比1.8～2.2vvm，转速250～400rpm，溶氧30％～40％的条件下，发酵培养34～38h，制得发酵液。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，洗涤菌体采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中的离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中，脱色步骤如下：

将步骤(d)制得的混合溶液，按质量百分比0.5～1％的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h；

优选的，所述步骤(d)中，离交步骤如下：

将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在35～55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％；

优选的，所述步骤(d)还包括将制得的果糖、葡萄糖的混合液与步骤(c)的葡萄糖溶液混合，继续进行后续反应。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)中，浓缩采用四效降膜蒸发器，真空度为0.06～0.09Mpa，料液温度50～85℃，浓缩至原体积的60～75％；

优选的，所述步骤(e)中，色谱分离步骤如下：

色谱运行压力0.20～0.30MPa，温度60～70℃，水耗比1:(1.3～1.6)，每小时进料1.5～2.0m³，分别收集D-阿洛酮糖和果糖、葡萄糖的混合液。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：

浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体；

优选的，所述步骤(e)中，结晶反应条件为：

糖液质量浓度70～85％，温度50～70℃，添加溶质质量10～30％的晶种，搅拌均匀，于50～70℃静置8～16小时，随后按照3～6h降1℃的速率缓慢降温，同时缓慢搅拌，直至溶液中形成大量均匀、规则的晶粒，分离，制得D-阿洛酮糖。