[发明专利]MDBK驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺

权利要求书

1.一种悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：

1)细胞生长：悬浮MDBK细胞在生长培养基中生长至2.0×10⁶细胞/mL～20.0×10⁶细胞/mL；

2)接毒：接毒量在10^-1～10^-5MOI之间，或者在步骤3)之后按照此接毒量接毒；

3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1～5倍，稀释后细胞密度到1.0×10⁶细胞/mL～10.0×10⁶细胞/mL；

4)二次生长：细胞二次生长；

5)任选地，收获病毒液纯化制苗。

2.根据权利要求1所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中悬浮MDBK细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30L及以上。

3.根据权利要求1或2所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤1)中细胞密度在5.0×10⁶细胞/mL～16.0×10⁶细胞/mL，优选地，6.0×10⁶细胞/mL～15.0×10⁶细胞/mL，最优选地，10.0×10⁶细胞/mL。

4.根据权利要求1至3任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤2)中细胞接毒量在10^-1～10^-4MOI之间，更优接地，10^-1～10^-3MOI，最优接地，10^-2MOI。

5.根据权利要求1至4任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤3)中悬浮MDBK细胞生产培养基稀释为1～4倍，更优选地，1～3倍稀释，最优选为2倍稀释。

6.根据权利要求1至5任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤3)中接毒后细胞密度在1.0×10⁶细胞/mL～10.0×10⁶细胞/mL，优选地，4.0×10⁶细胞/mL～10.0×10⁶细胞/mL。

7.根据权利要求1至6任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中悬浮MDBK细胞为疫苗生产所用的悬浮细胞，或是由贴壁MDBK细胞驯化而来、能够悬浮生长生产的悬浮MDBK细胞，优选地，悬浮MDBK细胞是由贴壁MDBK细胞经低血清驯化或无血清驯化而来，所述无血清驯化是指驯化后的MDBK细胞可在无血清存在的培养基中生长、增殖，和/或，优选地，悬浮MDBK细胞是由贴壁MDBK细胞经悬浮驯化而来。

8.根据权利要求1至7任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中病毒为在对应悬浮MDBK细胞上敏感、能够生产出对应疫苗的病毒，优选地，病毒选自病毒性牛腹泻疫苗或牛传染性鼻气管炎疫苗。

9.根据权利要求1至8任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中细胞生长温度在35℃～37℃，接毒后病毒生产温度在30℃～37℃。

10.根据权利要求1至9任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中细胞生长接种密度在0.3×10⁶细胞/mL～1.0×10⁶细胞/mL细胞，生长天数在2～8天达到最高细胞密度。