[发明专利]ST细胞驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺

说明书

本发明涉及ST细胞驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺。具体而言，本发明涉及驯化贴壁ST细胞使其适应无血清悬浮培养，并以其为宿主细胞，采用二阶培养接毒方式生产能在悬浮ST细胞上病变或有敏感性的病毒，即，细胞长至2.0～20.0×10⁶细胞/mL时，用生产培养基稀释1～5倍，使密度在1.0～10.0×10⁶细胞/mL之间，然后接毒，或在稀释之前接毒。本发明的悬浮ST细胞适应在无血清和化学成分确定的培养基中悬浮生长，其二阶病毒生产工艺简单，易放大；不换液，培养基利用效率高；生产和生长培养基可以相同或不同，二者按照比例混合，即可使细胞二次生长并促进病毒表达。

技术领域

本发明涉及ST细胞驯化悬浮方法和悬浮ST细胞相关疫苗生产领域，具体涉及30L及以上的生物反应器培养悬浮ST细胞、以二阶培养方法培养悬浮ST细胞以生产疫苗的工艺技术。

背景技术

哺乳动物细胞大规模培养技术是生物制药企业下游通用技术之一，其在该行业发挥极为重要的作用。该项技术的关键在于实现哺乳动物细胞的悬浮无血清大规模培养，从而提高产能，降低成本，并易于放大。贴壁细胞培养时的通常做法是在培养基中添加一定量血清使细胞贴壁生长，而血清化学成分不确定，且质量不稳定，有批间差，用此种细胞生产的生物制品，质量难以控制，很难通过食品药品监督管理局的审批，而悬浮无血清培养相对常见的贴壁培养来说，单位体积能生长更多的细胞，从而能生产更多的生物制品。

ST细胞为猪睾丸细胞(swine testis)，该细胞现已广泛应用于猪瘟病毒(SFV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(SFV)等的分离、体外增殖以及多种兽用疫苗的生产。

现有的ST细胞驯化悬浮的缺陷在于：1、有的无法实现完全无血清培养；2、一般采用两步走的方法，即先降为无血清再悬浮培养，由于贴壁培养采用的培养基通常为基础培养基加血清，基础培养基营养成分较弱，驯化过程中贴壁培养表面积/体积比通常较小，限制了营养的摄入，整个驯化过程耗时长；3、基因修饰后驯化，即通过基因改造，为贴壁细胞株插入不利于贴壁的基因片段，改变原有的贴壁培养方式，使细胞悬浮生长，然后再通过培养基的不断优化与改变使细胞能够无血清高密度生长，此种办法容易实现，但是插入了外源基因片段，影响产品的质量。因此，需要对ST细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法进一步研究，并克服以上三方面的缺陷。

在病毒接毒工艺方面，传统的病毒性疫苗生产工艺是指细胞生长到一定密度后，换液再接毒或者直接接毒。截至目前，并未有关于悬浮ST细胞的二阶培养方法的相关报道。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种悬浮ST细胞疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：

1)细胞生长：悬浮ST细胞在生长培养基中生长至2.0×10⁶细胞/mL～20.0×10⁶细胞/mL；

2)接毒：接毒量在10^-1～10^-5MOI之间，或者在步骤3)之后按照此接毒量接毒；

3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1～5倍，稀释后细胞密度到1.0×10⁶细胞/mL～10.0×10⁶细胞/mL；

4)二次生长：细胞二次生长；

5)任选地，收获病毒液纯化制苗。

在一些实施方案中，悬浮ST细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30L及以上。

在一些实施方案中，步骤1)中细胞密度在4.0×10⁶细胞/mL～15.0×10⁶细胞/mL，优选地，5.0×10⁶细胞/mL～12.0×10⁶细胞/mL，最优选地，10.0×10⁶细胞/mL。