[发明专利]小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法

说明书

本发明提供了一种小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT‑PCR快速检测方法，包括小反刍兽疫病毒引物对和探针，蓝舌病病毒引物对和探针，其中两组探针的5’端和3’端分别用不同的荧光报告基团及配套的荧光淬灭基团标记。该快速检测方法能够对单个样本一次性检测两种病毒，具有敏感、高效的优点，临床应用价值优异。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基于病毒核酸序列的基因检测试剂盒，及其检测方法。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)又称羊瘟，是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起小反刍兽的急性接触性传染病，以发热，口腔、舌黏膜糜烂，流泪，流鼻液，腹泻和肺炎为特征；蓝舌病(Bluetongue，BT)是由蓝舌病病毒(BTV)引起反刍动物的非接触性传染病，以高热，口腔、鼻腔和胃肠道黏膜水肿，溃疡性炎症变化为特征。小反刍兽疫病毒(PPRV)主要感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚、努比亚野山羊、长角羚及其它小反刍兽。骆驼、猪和牛也可感染，但通常无临床症状。蓝舌病病毒(BTV)对绵羊、山羊和牛易感，一般情况下，绵羊感染后的临床症状明显，山羊和牛呈隐性感染。小反刍兽疫和蓝舌病(以下简称“两病”)在我国均列为一类动物疫病，在我国周边国家及国内多个省份都有发生，特别是羊的小反刍兽疫近年疫情形势严峻。羊在感染“两病”后的临床症状不易鉴别，且近年发现“两病”常有双重混合感染的情形存在，在国外被称为小反刍兽的跨界疾病。但是现行缺乏快速检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的方法，给后续开展的防控、检疫工作带来很大的困难。

对“两病”的诊断，一般是采用Elisa抗体筛查、单重RT-PCR或普通RT-PCR检测的方式。由于动物交易活跃，动物免疫背景不清，导致Elisa抗体筛查结果并不准确；单重RT-PCR费时费力，无法满足高通量检测的需求；而普通PCR的检测敏感性较差。

发明内容

本发明旨在提供一种利用双重荧光RT-PCR快速同时鉴别小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法，包括RT-PCR反应液、酶混合液、小反刍兽疫病毒/蓝舌病病毒双重反应液和去RNA酶水。其中小反刍兽疫病毒/蓝舌病病毒双重反应液包括：(1)一对小反刍兽疫病毒引物和一条小反刍兽疫病毒探针组成；(2)一对蓝舌病病毒引物和一条蓝舌病病毒探针组成。

具体引物和探针如表1所示。

表1双重荧光RT-PCR引物和探针

进一步，小反刍兽疫病毒探针用ROX荧光报告基团和BHQ2荧光淬灭基团标记，蓝舌病病毒探针用FAM荧光报告基团和BHQ1荧光淬灭基团标记。

进一步，所述RT-PCR的扩增程序为：42℃15min；95℃3min；95℃15s，55℃45s，共40个循环。

本发明提供的小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法，对单个样本一次性检测两种病毒，具有敏感、高效的优点，临床应用价值优异。

附图说明

图1是小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法特异性检测曲线图；

图2是小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法灵敏度检测曲线图；

图3是小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒双重荧光RT-PCR快速检测方法样品检测曲线图。