[发明专利]一种基于双Aptamer夹心结构开启环介导等温扩增的凝血酶检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于双Aptamer夹心结构开启环介导等温扩增的凝血酶非疾病诊断目的的检测方法，其特征在于，所述双Aptamer夹心结构包括亲和素修饰的微球载体和负载在所述微球载体上生物素化的凝血酶双Aptamer夹心结构，所述双Aptamer夹心结构的3’端带有一条游离单链序列，引发环介导等温扩增；

将所述双Aptamer夹心结构与LAMP初级基础结构混合；所述LAMP初级基础结构具有游离的3’突出末端，所述3’突出末端序列与所述双Aptamer夹心结构的3’端游离单链序列互补；所述LAMP初级基础结构的3’突出末端序列还带有Nb.BsrDI切刻内切酶的切割位点；

在Nb.BsrDI切刻内切酶作用下，所述双Aptamer夹心结构与LAMP初级基础结构结合并切割形成LAMP基础结构；

所述LAMP基础结构在引物的作用下进行环介导等温扩增，所述引物中至少包括一条含有G-四链体序列互补序列的引物，得到含有G-四链体序列的扩增产物；

将所述扩增产物与血红素混合，所述扩增产物中的DNA序列经解旋折叠后，形成G-四链体-血红素DNA酶，利用ABTS-H₂O₂反应进行凝血酶的检测；

所述LAMP初级基础结构由探针P3-1和探针P3-2同时与探针P3-COM互补结合，在Ampligase连接酶的作用下构建得到；

其中，所述探针P3-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针P3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述探针P3-COM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述LAMP初级基础结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述环介导等温扩增使用4条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～10所示。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述凝血酶双Aptamer夹心结构中包括核酸适配体P1和核酸适配体P2，所述核酸适配体P1为生物素修饰的核酸适配体，固定在所述微球载体上，所述核酸适配体P2的3’端带有一条游离单链序列，所述核酸适配体P1与所述核酸适配体P2分别与凝血酶特异性结合形成双Aptamer夹心结构。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述核酸适配体P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述核酸适配体P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP初级基础结构的构建条件为在90～98℃的温度下反应10～50s，再于30～40℃温度下反应5～10min，在上述条件下进行20～40个循环反应。

6.一种用于凝血酶检测的试剂盒，包括亲和素修饰微球、生物素化的核酸适配体P1、核酸适配体P2、凝血酶；探针P3-1、探针P3-2、探针P3-COM、Ampligase连接酶、Nb.BsrDI切刻内切酶、引物FIP、引物BIP、引物FLP-G4、引物BLP-G4、Bst DNA聚合酶、缓冲液、ABTS和H₂O₂；

所述生物素化的核酸适配体P1、核酸适配体P2、探针P3-1、探针P3-2和探针P3-COM的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示；

所述引物FIP、引物BIP、引物FLP-G4、引物BLP-G4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～10所示。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括Binding/wash缓冲液、BSA TB buffer、reactionbuffer、NEBuffer2.1缓冲液和LAMP等温扩增缓冲液。