[发明专利]靶向编辑兔H11基因座的基因序列及该序列的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物基因技术领域，具体涉及一种能够靶向编辑兔H11基因座的基因序列及该序列的应用。

背景技术

Hipp11(H11)基因座，首次由Hippenmeyer等人在2010年发现并且进一步在转基因小鼠和人类干细胞中验证。在小鼠中，Eif4enif1和Drg1基因之间是H11基因座，位于11号染色体着丝粒附近。体内实验证实在H11基因座的整合和双等位基因表达，不会干扰小鼠的活力或是生育力。相同的研究显示，与小鼠中的Rosa26位点相比，H11基因座显示高水平的全身转基因表达和染色体重组的高效性。2015年，Jin等人使用CRISPR/Cas9系统成功地将大于9kb的基因片段插入猪的H11基因座。还证实插入该位点的基因在细胞，胚胎和动物中也是高度表达的。Tasic等选择了H11基因座，插入整合酶，他们研究发现该位点拥有相对于Rosa26位点更高的整合效率。H11基因座不含有任何启动子，因此可以在目的基因自身启动子后表达，例如组织特异性启动子在该组织中特异性表达转基因。如果在兔的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因兔培育的技术体系。

近年来出现了许多基因编辑技术，包括锌指核酸酶(ZFNs)，转录激活因子类似效应因子核酸酶(TALENs)和RNA指导的CRISPR/Cas核酸酶系统。前两种技术是将核酸内切酶催化结构域与DNA结合蛋白组件连接，在特定的基因位点诱导靶向DNA双链断裂(DSB)的方法。相比之下，Cas9是通过Watson-Crick碱基互补配对原则，由核酸酶引导的小RNA与目的DNA配对。

CRISPR-Cas是一种微生物适应性免疫系统，使用RNA引导的核酸酶切割DNA。由于其高效的基因编辑效率，CRISPR-Cas系统已被应用于多种生物上，包括猪、秀丽隐杆线虫、鸡、大鼠、山羊、斑马鱼、细菌及植物。多个科研小组的研究都显示，与ZFN和TALEN相比较，借助CRISPR-Cas系统的基因编辑实验显示出更高的效率。借助于这一技术，基因功能研究及分子育种等都将得到迅猛的发展。

因此，寻求能高效的特异性靶向编辑H11基因座的CRISPR-Cas的gRNA序列，并在Cas9核酸酶的介导下对该位点进行靶向编辑，为进一步高效的制备外源基因在兔H11基因座定点整合的转基因兔中提供技术支持。

因此，一种提供的针对兔H11基因的gRNA，具有特异性和高效性的特点，能够进行外源基因的定点整合，这极大地提高了转基因兔制备的效率和安全性。同时，本发明提供的编码该gRNA的DNA序列，能通过构建PX330表达载体实现在体细胞、受精卵或个体水平上对兔H11基因实现靶向基因编辑，包括定点整合、定点修饰、定点突变。以此来进行兔H11基因功能分析和外源基因定点整合的转基因兔的生产的能够靶向编辑兔H11基因座的基因序列及该序列的应用被提出。

发明内容

本发明提供了能高效靶向编辑兔H11基因座的gRNA。将编码gRNA的双链DNA连入PX330表达载体，该表达载体能够表达出完整的gRNA去识别染色体上H11基因DNA序列，同时该载体还能表达出具有生物活性的Cas9核酸酶。2条gRNA均能够特异性地与兔H11基因座部分序列互补配对，介导Cas9核酸酶对兔H11基因座进行特异、高效地编辑。

本发明提供了一种靶向编辑兔H11基因座的gRNA及其应用，该gRNA序列包括特异编辑兔染色体上H11基因序列RNA片段和DNA片段，RNA片段的核苷酸序列如下1)或2)；DNA片段的核苷酸序列如下3)或4)。本发明所提供的gRNA能高效的特异识别兔H11基因座，并在Cas9核酸酶的介导下对该位点进行靶向编辑，其为后续制备H11基因座基因编辑兔和外源基因H11基因座定点整合转基因兔具有重要技术支持。

本发明提供能靶向编辑兔H11基因座的gRNA的RNA序列，其特征在于，识别染色体上兔H11基因序列的RNA序列如下1)或2)：

本发明提供能靶向编辑兔H11基因座的gRNA的DNA序列，其特征在于，识别染色体上兔H11基因序列的DNA序列如下3)或4)：

本发明提供能靶向编辑兔H11基因座gRNA的DNA序列的制备方法。步骤如下：

1)在基因库中检索出兔H11基因座DNA序列，选择靶向区域设计gRNA序列；

2)根据设计的gRNA序列，合成对应的DNA序列；

3)gRNA的DNA序列退火形成核苷酸二聚体(Coligoduplex}；