[发明专利]绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，提供了一种绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用。本发明提供的绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体，含有双荧光素酶报告基因载体和CNKSR2基因的3’UTR区序列片段，该重组载体可以稳定表达绵羊CNKSR2基因，作为一个生物模块用于各种相关技术领域；本发明提供的构建方法操作简便，可以通过筛选基因准确得到带有目的基因的重组载体，并且重组载体可以稳定表达目的基因；本发明提供的重组载体可以用于检测CNKSR2基因表达活性，同时筛选得到靶向调控CNKSR2基因的miRNA‑21，miRNA‑21负调控抑制CNKSR2基因表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用。

背景技术

动物皮毛的生长极为复杂，受到遗传、外界环境、代谢、营养等各种因素的影响。遗传因素作为皮毛生长的决定性因素，许多基因都直接或者间接的影响动物毛发生长，研究发现CNKSR编码一个新的参与Ras信号通路调节的蛋白CNK，CNKSR同源序列之一的CNKSR2在人脑组织和皮肤组织中表达，由CNKSR2编码表达的蛋白质被命名为CNK2，CNK2具有多个结构域，作为接头蛋白参与MAPK信号通路的调节。其中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是真核细胞转导细胞外信号到细胞内并引起细胞反应的一类重要的信号通路，从而影响细胞的生长、增殖和分化，对动物毛发的生长和发育有着重要的作用。众多研究显示，与毛囊生长发育有关的200多种分子中，MAPK信号传导途径占到分子总数的19.53％。

MicroRNA(即miRNA)是由18-25个核苷酸组成的一类内源性、短序列非编码单链RNA，它由DNA转录产生，不翻译蛋白质，通过和mRNA3'UTR区结合来调控目标基因的表达。miRNA主要是通过5'端被称为种子序列的7nt序列与位于靶mRNA3'UTR的miRNA调控元件相互作用以识别靶mRNA。作为一种转录后调控小分子RNA，在动物中主要通过与靶mRNA的3'UTR区特异性互补配对，抑制靶mRNA翻译或引起靶mRNA的降解，从而参与调控细胞分化、组织发育、肿瘤发生发展等多种生命过程。成熟的miRNA可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高。miRNA作为转录后基因调控的一种方式，在生物体内形成一个调控网络，由于miRNA调控涉及的方便广，调控控作用明显，本身序列短，便于操作和研究，越来越受到人们对其生物学功能研究的重视。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体，本发明的第二目的在于提供上述绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体的构建方法，本发明的第三个目的在于提供上述绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体在检测绵羊CNKSR2基因表达活性中的应用，本发明的第四个目的在于提供绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体在筛选调控绵羊CNKSR2基因的microRNA上的应用，本发明的第五个目的在于提供上述绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体在检测microRNA调控绵羊CNKSR2基因的调控机制中的应用，以缓解现有技术中对绵羊CNKSR2基因的调控机制的研究内容和方法不完善的问题，提供一种绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法，同时预测调控绵羊CNKSR2基因的miRNA。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体，所述绵羊CNKSR2基因双荧光素酶报告基因载体含有双荧光素酶报告基因载体和CNKSR2基因的3’UTR区核苷酸序列片段。

进一步地，所述双荧光素酶报告基因载体为pmiR-RB-REPORT^TM。