[发明专利]一种红耳龟胚胎成纤维细胞系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种红耳龟胚胎成纤维细胞系及其构建方法。它是取孵化至第12～18d的红耳龟卵，挑选活胚后对红耳龟卵进行消毒，去壳取红耳龟胚，弃头、四肢及内脏，余下的胚胎组织用含双抗的PBS冲洗至无明显血迹；将冲洗至无明显血迹的胚胎组织用胰蛋白酶消化，收集消化下来的单细胞，将单细胞接种于完全培养基中静置培养，当细胞部分贴壁且稍加振荡也不浮起时，吸去完全培养基和尚未贴壁的细胞，剩下的贴壁细胞加入新的完全培养基后继续培养；当原代培养的细胞汇合度达到90％以上时，用胰蛋白酶消化，收集单细胞，再接种于完全培养基中进行传代培养。本发明为进一步利用RSTEFs进行基础理论和实验研究奠定了材料和技术基础。

技术领域：

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种红耳龟胚胎成纤维细胞系及其构建方法。

背景技术：

红耳龟(Trachemys scripta elegans)又名巴西龟，原产于美国中部至墨西哥北部，由于国际贸易的原因，该种已被引入欧洲、非洲、澳洲、亚洲以及美洲等许多国家，成为世界性的危险入侵物种。同时红耳龟价格低廉、数量多，也是动物学、生理学、医学等研究的实验动物。研究表明，红耳龟对温度变化、饥饿、高盐胁迫和酸胁迫具有较强的耐受性，然而目前这些研究主要涉及生理生化表型性状层面，尚未深入至细胞学和分子机制，其重要原因可能是红耳龟细胞的体外培养技术不成熟，缺乏能够用于实验研究的相关细胞系。目前已报道的体外培养的龟类细胞仅有卡罗来纳箱龟(Terrapene carolina)心脏细胞，西部锦龟(Chrysemys picta bellii)、蛇鳄龟(Chelydra serpentina)、美国鳖(Apalone mutica)的肝脏和脾脏细胞，绿海龟(Chelonia mydas)心脏、肝脏等13种细胞，红海龟(Carettacaretta)、鹰嘴海龟(Eretmochelys imbricata)、多盾海龟(Lepidochelys olivacea)成纤维细胞和中华鳖心脏细胞等少数几个品种。本专利旨在建立稳定的红耳龟胚胎成纤维细胞(Red-eared slider turtle embryonic fibroblasts,RSTEFs)分离培养体系，为从细胞水平深入研究红耳龟对逆境胁迫的耐受机制，以及相关生理学、医学研究奠定材料和技术基础。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种红耳龟胚胎成纤维细胞系及其构建方法，为从细胞水平深入研究红耳龟对逆境胁迫的耐受机制，以及相关生理学、医学研究奠定材料和技术基础。

本发明的第一个目的是提供红耳龟胚胎成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤：

a)胚胎的处理：取孵化至第12～18d的红耳龟卵，挑选活胚后对红耳龟卵进行消毒，去壳取红耳龟胚，弃头、四肢及内脏，余下的胚胎组织用含双抗的PBS冲洗至无明显血迹；

b)原代培养：将冲洗至无明显血迹的胚胎组织用胰蛋白酶消化，收集消化下来的单细胞，将单细胞接种于完全培养基中静置培养，当细胞部分贴壁且稍加振荡也不浮起时，吸弃完全培养基和尚未贴壁的细胞，剩下的贴壁细胞加入新的完全培养基后继续培养；

c)传代培养：当原代培养的细胞汇合度达到90％以上时，用胰蛋白酶消化，收集单细胞，再接种于完全培养基中进行传代培养。

所述的挑选活胚后对红耳龟卵进行消毒具体为：将挑选有活胚的红耳龟卵用体积分数6％新洁尔灭溶液浸泡3min。

所述的传代培养的接种比例优选为1:2～3。或者，所述的传代培养的接种密度优选为1.25～2.5×10⁴/cm²。

所述的原代培养和传代培养的培养条件均优选为：饱和湿度，30～34℃，5％CO₂。进一步优选为：饱和湿度，34℃，5％CO₂。