[发明专利]一种双链核酸片段加接头的方法、文库构建方法和试剂盒

权利要求书

1.一种双链核酸片段加接头的方法，其特征在于：在双链靶标核酸片段的3’末端连接3’端侧向接头；

所述双链靶标核酸片段包含连接位点，所述连接位点具有包含3’-羟基的3’末端，所述连接位点为单链缺刻产生的切口、单链核苷酸缺失产生的缺口或5’端突起；

所述3’端侧向接头具有包含5’-磷酸的5’平端，以及非连接性的3’末端；

所述连接3’端侧向接头的方法包括，采用T4连接酶，在连接反应条件下，使双链靶标核酸片段的连接位点的3’-羟基，与3’端侧向接头的5’平端的5’-磷酸发生连接反应，将双链靶标核酸片段与3’端侧向接头连接。

2.根据权利要求1所述的双链核酸片段加接头的方法，其特征在于：所述3’端侧向接头中，非连接性的3’末端为连接有阻断基团，并被阻断基团阻断的末端；所述阻断基团为双脱氧核苷酸或3’-磷酸基团。

3.根据权利要求1所述的双链核酸片段加接头的方法，其特征在于：所述连接位点为单链缺刻产生的切口，所述双链核酸片段加接头的方法还包括采用具有5’端外切酶活性的酶处理所述双链靶标核酸片段，切除所述切口处的一个或多个核苷酸，形成核苷酸缺失的缺口。

4.根据权利要求1所述的双链核酸片段加接头的方法，其特征在于：所述连接反应条件包括采用PEG或单链结合蛋白SSB蛋白或其组合物，对所述双链靶标核酸片段与所述3’端侧向接头进行连接。

5.一种文库构建方法，其特征在于：所述文库包括多个双链靶标核酸片段，文库构建方法包括，

构建环状核酸样本，每个环状核酸样本中包括一个双链靶标核酸片段和双链结构的第一接头，所述第一接头中含有单链缺刻产生的切口或单链核苷酸缺失产生的缺口；

对所述环状核酸样本进行可控的切口平移，将所述切口或缺口可控的平移到所述双链靶标核酸片段内，获得切口平移产物；

所述可控的切口平移包括，在具有切口或缺口的环状核酸样本上进行DNA聚合酶驱动的合成反应，通过控制反应的时间和温度来控制5’至3’方向的聚合酶驱动的DNA合成，从而将切口或缺口可控的平移到所述双链靶标核酸片段内；

在所述切口平移产物的所述切口或缺口处连接3’端侧向接头，获得连接产物；所述切口或缺口处具有包含3’-羟基的3’末端，所述3’端侧向接头具有包含5’-磷酸的5’平端，以及非连接性的3’末端；连接3’端侧向接头的方法包括，采用T4连接酶，在连接反应条件下，所述切口或缺口处的3’-羟基与3’端侧向接头的5’平端的5’-磷酸发生连接反应，从而将所述3’端侧向接头连接到所述切口平移产物的所述切口或缺口处；

在所述连接产物的3’端侧向接头上杂交引物，通过杂交引物进行可控的延伸，延伸至所述双链靶标核酸片段内的指定位置，获得引物延伸产物；所述可控的延伸包括，通过杂交引物进行DNA聚合酶驱动的合成反应，通过控制反应的时间和温度来控制5’至3’方向的聚合酶驱动的DNA合成，从而起到控制延伸，并延伸至所述双链靶标核酸片段内的指定位置的作用；

在所述引物延伸产物的5’端连接5’端接头，获得配对的双接头文库，每个双接头文库包括：5’端接头、双链靶标核酸片段的第一端部分、第一接头、双链靶标核酸片段的第二端部分，和3’端侧向接头；

所述双链靶标核酸片段的第一端部分，即引物延伸的所述指定位置到所述双链靶标核酸片段3’末端的部分；所述双链靶标核酸片段的第二端部分，即所述双链靶标核酸片段的5’末端到所述切口或缺口处的部分。

6.根据权利要求5所述的文库构建方法，其特征在于：所述构建环状核酸样本的方法包括，将双链结构的第一接头的两条链拆分作为两个单接头链，两个单接头链分别与所述双链靶标核酸片段的两端连接，形成粘性末端，双链靶标核酸片段两端的粘性末端互补连接，形成所述第一接头，产生环状核酸样本。

7.根据权利要求5所述的文库构建方法，其特征在于：所述第一接头中含有至少一个尿嘧啶残基，所述文库构建方法包括切除所述尿嘧啶残基，在所述第一接头中产生所述切口或所述缺口。