[发明专利]一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦方法，步骤包括：⑴将小麦种子培养至胚芽鞘长0.5‑1cm；⑵将含有目的基因的农杆菌用YEB培养液振荡培养；⑶用注射器针头蘸取准备好的农杆菌针刺茎尖生长点的位置；⑷将针刺后的小麦外植体在25℃黑暗培养2天；⑸然后将小麦农杆菌侵染后的外植体转入蛭石营养土中，在温室中培养。用本发明的方法可以快速获得转基因小麦株系，可以培育出各种抗逆的小麦新种质。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中一种培育转基因植物的方法及应用，涉及一种农杆菌介导的、针刺幼芽生长点转化小麦的方法。

背景技术

小麦是最重要的粮食作物之一，全世界40％的人口以小麦为主食。2015年全球小麦的种植规模为2.24亿公顷，总产量为6.9亿吨。在我国北方，小麦是种植面积最大的粮食作物。各种生物逆境和非生物逆境是影响我国小麦的生产面临的重要威胁。小麦遗传转化困难等问题严重影响小麦功能基因组学的进展和研究。这些难题的解决有赖于小麦基因工程的进程。

由于小麦的基因组巨大，遗传背景复杂，遗传转化困难，是三个重要的禾本科作物中最后一个获得转基因成功的。尽管从1992年以来利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法、PEG法、电激法和激光微束法分别获得了转基因小麦，但其转化率都比较低。由于基因枪等物理转化法获得的转基因小麦存在外源基因的拷贝数多、再生困难和不育等缺陷，使小麦基因转化技术已成为限制小麦基因工程研究发展的重要因素。由于这种限制，至今获得的有经济价值的转基因小麦极其有限。与其他转化方法相比，农杆菌介导的小麦转化具有操作简单、培养周期较短等特点，更重要的是外源基因插入的拷贝性和完整性以及转基因植株可育植株比例高等优点。因此研究一套农杆菌介导的快速、高效小麦转化系统以突破小麦基因工程瓶颈具有重要的理论意义和巨大的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的小麦针刺茎尖转化方法，本方法不仅容易操作、费用低、高效率，能够显著提高植株的存活率，减少了外植体感染农杆菌污染的几率，而且不需要经过复杂的组织培养、能够得到大量的阳性后代等特点，具有很高的实际操作性及应用价值。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法，包括以下步骤：

⑴将消毒后的小麦种子在湿润的培养皿中培养至胚芽鞘长0.5-1cm；

⑵将含有目的基因的农杆菌用YEB培养液振荡培养，当菌液OD600浓度为0.5时，加入200μM乙酰丁香酮，培养至OD600浓度为0.6时备用；

⑶用注射器针头蘸取准备好的农杆菌针刺茎尖生长点的位置；

⑷将针刺后的小麦外植体在25℃黑暗培养2天；

⑸然后将小麦农杆菌侵染后的外植体转入蛭石营养土中，在温室中培养。

而且，所述步骤⑴中小麦种子消毒的方法为：用95％酒精洗2min，然后用20％次氯酸钠处理10min，无菌水冲洗3次。

而且，所述农杆菌的YEB培养液配方为胰蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl2g/L，农杆菌培养温度为28℃。

而且，所述含有目的基因的农杆菌是含有插入表达载体后的重组质粒，优选农杆菌菌株为EHA105、GV3101或AGL1。

而且，所述农杆菌的表达载体为植物表达载体，优选pCAMBIA系列载体。

而且，所述遗传转化的外植体为小麦种子萌发后时得到的茎尖，胚芽鞘大概0.5-1cm，0.8cm。

而且，步骤⑶所述的针刺生长点的位置的操作为：与胚芽鞘生长方向垂直，用5号注射器针头刺入生长点位置，操作前掰几个胚芽判断生长点的准确位置，大约1.5mm后迅速拔出。