[发明专利]一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待检乳样的前处理：向待检乳中加入PMA，然后置于暗处进行预孵育，接着置于650W卤素灯下照射曝光；本步骤操作均在冰浴上进行；

(2)样品DNA的提取：向步骤(1)处理后的待检乳中加入柠檬酸钠和氢氧化钠，然后离心，弃上清，得沉淀；

(3)用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后离心，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，得到提取物；

(4)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；

(5)鉴定：取LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测；若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中含有单增李斯特活菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中不含有单增李斯特活菌。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于步骤(1)中PMA的终浓度为50μM～200μM。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于步骤(1)中置于暗处预孵育5min～10min。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于步骤(1)中置于距650W卤素灯20cm处照射。

5.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于步骤(1)中曝光时间为5min～9min。

6.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于步骤(2)中柠檬酸钠和氢氧化钠的终浓度分别为250g/L和1mol/L。

7.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于步骤(4)中LAMP扩增的反应体系为25μL，由下列成分组成：FIP引物(40μM)1μL，BIP引物(40μM)1μL，F3引物(5μM)1μL，B3引物(5μM)1μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs(10mM)4μL，MgSO₄(25mM)4μL，甜菜碱(12.5mol/L)2μL，Bst2.0 DNA酶(200U/μL)1μL，模板DNA 2μL，加入ddH₂0加至25μL；LAMP扩增条件为：63℃1h，80℃2min终止反应。