[发明专利]用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及化合物检测领域技术，尤其是涉及一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法。

背景技术

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)是分别起源于肾上腺髓质的嗜铬细胞或肾上腺外的交感神经节细胞的肿瘤。PPGL会分泌大量的儿茶酚胺，包括肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)及多巴胺(DA)，造成患者的血压阵发性或持续性的升高。尽管PPGL患者只占普通高血压患者的0.2％～0.6％，但是这些患者若未能及时得到针对性治疗，长期的高血压可对患者的心、脑、肾等器官造成严重损害。有些患者甚至会发生高血压危象，危及生命。而患者若能在早期得到准确、及时的诊断，通过手术切除肿瘤，高血压可得到治愈。传统的PPGL生化检查是检测血或尿中的肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。然而，这类方法对PPGL诊断的灵敏度和特异性均不理想。为了解决上述问题，中华医学会内分泌协会和美国内分泌协会推荐试用儿茶酚胺的代谢产物变肾上腺素(MN)和变去甲肾上腺素(NMN)作为诊断PPGL的首选指标。目前临床中用于检测变肾上腺素和变去甲肾上腺素的浓度的方法有酶联免疫法、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱电化学法，其中酶联免疫法的灵敏度较低，电化学法易存在对目标峰的干扰。

由于肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)以及其代谢产物变肾上腺素(MN)、变去甲肾上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)均具有较高的极性，而且分子结构相近，这就对上述化合物的分离方法提出了较为苛刻的要求。尽管现有技术中报道过采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)分离上述化合物，但是一种液相色谱串联质谱法通常只能分离上述6种化合物中的一部分化合物，不能将上述6种化合物一次性有效地分离。如果要想从生物样品中检测上述6种化合物来诊断PPGL，需要采用不同的液相色谱串联质谱法的组合。这导致了检测时间的过度延长，很大程度上抑制了其在临床上的应用。因此，目前迫切需要一种能够高效地从生物样本中一次性检测出上述儿茶酚胺及其代谢产物的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，提供了一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法，该方法采用LC-MS/MS可以快速地检测生物样本中的肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、变肾上腺素(MN)、变去甲肾上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)和多巴胺(DA)，可以用于全面地诊断和排查各种类型的PPGL。

具体而言，本发明提供了一种用液相色谱串联质谱技术检测儿茶酚胺及代谢产物的方法，包括：

(1)将250μL的醋酸铵溶液、100μL的儿茶酚胺及其代谢产物的内标溶液、200μL的生物样本，充分混匀后形成待测样本溶液，待用；

(2)将N个浓度不同的200μL儿茶酚胺及其代谢产物的标准品溶液分别与250μL的醋酸铵溶液、100μL的儿茶酚胺及其代谢产物的内标溶液混匀形成N个标准品混合溶液，待用；其中N为4至10的整数，优选5至8的整数。

(3)将弱阳离子交换96孔固相提取板分别用200μL甲醇和水进行预处理；然后分别将以上混匀的样品溶液和标准品溶液加载至经过预处理的各孔中，待样品加载完成后，分别用200μL的醋酸铵溶液与乙腈/异丙醇混合液清洗样品孔，然后用2份50μL的含有甲酸的乙腈水溶液洗涤样品孔，并将洗脱液收集在接收板中；取10μL洗脱液进入LC-MS/MS系统分析；

其中，LC-MS/MS系统的色谱条件为：色谱柱为Xbridge BEH Amide，柱温35℃；流动相A:100％水，含有10mM甲酸铵；流动相B：85％乙腈、15％水，含有10mM甲酸铵，流速：0.4ml/min；梯度洗脱；质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描，离子源喷雾电压：3600V，离子传输管温度：350℃，雾化温度：330℃。

将N个含有内标的儿茶酚胺及其代谢物的标准品混合溶液通过固相提取板处理，进入LC-MS/MS分析后，将标准品出峰面积同内标出峰面积的比值与标准品溶液浓度做线性回归；得到6种化合物的标准曲线。然后，根据待测样本中的6种化合物的出峰面积同内标出峰面积的比值，通过标准曲线计算生物样本中6种目标化合物的浓度。其中，6种化合物分别是肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、变肾上腺素(MN)、变去甲肾上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)和多巴胺(DA)

优选地，所述生物样本是血浆。

所述儿茶酚胺及其代谢产物的标准品溶液包含：