[发明专利]一种暹罗鳄血粉增强小鼠免疫功能的方法

说明书

一种暹罗鳄血粉增强小鼠免疫功能的方法，采用6.4、1.6、0.4mg/kg bw剂量的鳄鱼血粉给小鼠经口灌胃30d，进行小鼠脾淋巴细胞增殖反应实验、单核巨噬细胞吞噬实验、NK细胞杀伤细胞实验。

技术领域

本发明涉及一种暹罗鳄血粉增强小鼠免疫功能的方法，具体地说是以一种暹罗鳄血粉增强小鼠免疫功能的方法。

背景技术

目前公知的随着鳄鱼人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发，包括旅游观赏、餐饮加工、时装皮具等。自1999年Sharbanay报道海水鳄血清有抗菌活性以来，国外、国内许多学者对鳄鱼血的功效进行了研究，发现鳄鱼血具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的作用，鳄鱼血的这些功能是否是通过调节免疫来实现的呢，关于鳄鱼血的免疫增强作用尚未见报道。

发明内容

材料与方法 1、材料与试剂；鳄鱼血采自人工养殖暹罗鳄(Crocodylussiamensis)，来源于海南三亚龙虎园养殖场，本试验室制备。清洁级 BALB/C 小鼠，雄性，60只，18～22g。刀豆蛋白 A(ConA)、染液、Hanks 液(pH7.2～7.4) RPMI1640 完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑 (INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Tris-HCl 缓冲液(pH8.2)、1%NP40、台盼兰、1mol/L 盐酸等。2、仪器与设备；5mm直径打孔器、显微镜、微量血凝试验板、离心机、酶标仪、96 孔培养板、5%CO2 培养箱、200 目筛网、注射用墨汁、721 型分光光度计。3、动物实验分组与剂量设定；实验动物用于2项实验，分别为碳廓清实验和脏器/体重实验、小鼠脾淋巴细胞转化实验。每项50只动物，分为5个组，每组10只动物，分别为对照组、4倍人体摄入量组、1倍人体摄入量组、0.25倍人体摄入量组和猪血对照组。1倍人体摄入量为400mg/天。灌胃体积为0.2ml/20gbw。4、指标测定 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验；小鼠连续灌胃30d后，颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，经200目筛网过滤，制成单细胞悬液，将细胞悬液分为两部分，用于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验。用Hanks液洗涤细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，台盼兰染色计数活细胞数(在95%以上)，调整细胞浓度为3×106个/ml。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μlConA液作为实验，另一孔作为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含血清的RPMI1640培养液，同时加入 MTT 50μl/ 孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。以实验孔与对照孔OD的差值代表淋巴细胞增殖能力。小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)；实验前24h按常规培养靶细胞、效应细胞，取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl、靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μl，上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将培养板1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μl置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)；小鼠连续灌胃30d后，每鼠腹腔注射2% 鸡红细胞悬液 1ml。30min后，颈椎脱臼处死动物，仰位固定于蜡板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37℃孵箱温育30min。孵毕，在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞。晾干，以1:1(V/V)丙酮甲醇溶液固定20min，4%(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，于显微镜下计数巨噬细胞。统计学方法；测定结果数据均用x±s表示，用SPSSl6.0软件对结果进行t检验统计学处理，P＜0.05为差异有显著性意义。对于NK细胞杀伤活性的实验。