[发明专利]一种维甲酸联合卡介苗诱导HL-60细胞分化的方法

说明书

一种维甲酸联合卡介苗诱导HL‑60细胞分化的方法，HL‑60细胞株在完全培养基中培养，以GM‑CSF、IL‑4、TNF‑α等共处理，只在实验组加用卡介苗和ATRA。

技术领域

本发明涉及一种维甲酸联合卡介苗诱导HL-60细胞分化的方法，具体地说是以一种维甲酸联合卡介苗诱导HL-60细胞分化的方法。

背景技术

目前公知的树突状细胞（Dendriticcell，DC）是体内功能最强大的抗原递呈细胞(APCs)，其能启动自身特异性杀瘤免疫反应，但DC在人体内所占数量极微。目前，以末梢血中的单核细胞或CD34+细胞，可以诱导培养出大量DCs。国内外有大量实验证明白血病细胞用经典的方法能被诱导成DC。但用经典的方法培养，HL-60细胞很难培养成树突状细胞。

发明内容

材料和方法 1、细胞和主要试剂；IL-12 ELISA为试剂盒为晶美生物公司产品，rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α为Bioscience公司产品，抗人CD1a-PE、CD1d-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC单抗为Burlingame公司产品，ATRA为山东良福集团制药有限公司产品，卡介苗（ BCGV）上海生物制品研究所。2、细胞培养；HL-60细胞在含体积分数为10%的小牛血清的RPMI-1640完全培养液中，在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中贴壁培养，隔日换液，根据细胞增殖密度进行传代。3、实验分组；调整细胞浓度为1×106/ml，分别接种于24孔培养板（1ml/孔）。ATRA溶解于无水乙醇。实验组依需加入ATRA（终浓度为1×10-6 mol/L）、rhGM-CSF（终浓度为1000U/ml）、rhIL-4（终浓度为500U/ml）、卡介苗（终浓度为3×104cfu），在培养第8天时，加入100ng/ml的TNF-a，继续培养72小时。对照组使用rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-a和无水乙醇作为对照。空白对照组仅使用rhGM-CSF及rhIL-4及TNF-a。4、DC的形态及表型检测；倒置显微镜动态观察细胞并摄片，将培育DC浓度调节为1×106/ml，取细胞悬液100μl/管，分别加入CD1a-PE、CD1d-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE及HLA-DR-FITC单抗各15μl，混匀反应30min，流式细胞仪进行分析。5、IL-12测定；上清液IL-12水平测定，具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。6、CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）；L-DCs用丝裂霉素(25μg／L)处理1h去增殖后作为刺激细胞，刺激健康自愿者外周血T细胞(DC：T细胞分别为1：100，1：50，1：10，1：1)与2×105个／ml的T细胞在96孔圆底培养板中作用5天。总体积为每孔200μl，对每个浓度均作3个平行孔，每孔加入CCK8（20μl/孔）在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中培养4h，用酶标仪检测波长450nm时的吸光度(A)值，参比波长为630nm，结果取均值。算刺激指数(SI)。SI=实验孔的A值／对照孔的A值。统计学分析；采用SPSS16.0软件，所测数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用one-wayanalysisofvariance(ANOVA)统计方法分析分析。P<0.05表示有统计学意义。

结果；使用卡介苗和ATRA后获得了具有较明显树突状突起的细胞，DC表型CD83为(29.46±2.67)%、CD80为（65.23±4.65)%、CD86为(56±3.76)%、HLA-DR为(27.87±3.64)%及CD1d为(30.11±3.92)%，均明显升高(p<0.05)，上清液IL-12水平为(182.44±11.96 pg/ml)，亦明显升高(p<0.05)，并具有明显的MLR反应。