[发明专利]一种产(+)γ-内酰胺酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种产(+)γ‑内酰胺酶的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明提供了包含(+)γ‑内酰胺酶基因的重组质粒，(+)γ‑内酰胺酶基因经在591位点经密码子偏好性调整后在序列两端添加EcoRI限制酶切位点和NotI限制酶切位点，且在3’端加上六个组氨酸标签。所述重组毕赤酵母菌是以巴斯德毕赤酵母菌为表达宿主，包括所述重组质粒。产(+)γ‑内酰胺酶的重组毕赤酵母在发酵生产(+)γ‑内酰胺酶中的应用。与原核表达载体相比，采用酵母为表达载体的(+)γ‑内酰胺酶的产酶量提高了58％。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产(+)γ-内酰胺酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用。

背景技术

(-)2-氮杂双环[2,2,1]庚-5-烯-3-酮(简称(-)γ-内酰胺)是合成治疗HIV和疱疹病毒的抗病毒的碳环核苷类药物阿巴卡韦及抗流感的碳环核苷类药物帕拉米韦等的关键碳环功能团中间体。光学活性化合物的化学法合成，步骤多，成本高，不利于工业化生产的应用。相比化学合成方法，生物法具有产物手性(-)γ-内酰胺的光学纯度高，作为催化剂的γ-酰胺酶易于获得，条件温和，污染小等优点。能够水解拆分消旋伽马内酰胺的酶被称为伽马内酰胺酶，此类酶属于酰胺酶，其中(+)γ-内酰胺酶能高效拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯度高的手性(-)γ-内酰胺。

目前对(+)γ-内酰胺酶在大肠杆菌中的诱导表达研究比较深入，对其在毕赤酵母中诱导表达的研究较少，主要受(+)γ-内酰胺酶外源基因序列容易被真核生物本身存在的限制性内切酶酶解，不能在真核表达载体中正常表达。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种产(+)γ-内酰胺酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用，使构建的重组毕赤酵母能够成功表达，且具有较高的表达量的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种包含(+)γ-内酰胺酶基因的重组质粒，在载体pMD的EcoRI和NotI限制性酶切位点处连接有(+)γ-内酰胺酶基因；所述(+)γ-内酰胺酶基因第591位碱基由A突变为G，具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种产(+)γ-内酰胺酶的重组毕赤酵母菌，以巴斯德毕赤酵母菌Pichia pastoris为表达宿主，包括所述重组质粒。

本发明提供了一种所述的重组毕赤酵母菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的重组质粒进行线性化处理，将线性化的重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母菌中；

2)将步骤1)中电转化的巴斯德毕赤酵母菌在28～32℃条件下在液体培养基中静置培养2～6h；

3)将巴斯德毕赤酵母菌从所述步骤2)中液体培养基中分离，并接种到筛选培养基上进行筛选培养，得到重组毕赤酵母菌。

优选的，所述步骤1)中线性化处理为采用酶解法进行；所述线性化用酶的种类为SacI酶。

优选的，所述步骤1)中电转条件：电转化的电压为1.5Kv，电转化时间为3～5ms。

优选的，所述步骤3)中筛选培养基以液体培养基为基础培养基，包含质量浓度为80～120μg/mL遗传霉素和质量百分浓度为2％～3％琼脂粉；

所述液体培养基包括质量百分浓度的组分：1％酵母提取物，2％的胰蛋白胨，2％的葡萄糖，0.5％的山梨醇。

本发明提供了所述重组毕赤酵母或所述方法构建的重组毕赤酵母在发酵生产(+)γ-内酰胺酶中的应用。

优选的，所述发酵的培养基是质量百分浓度1％酵母提取物，质量百分浓度2％蛋白胨，质量百分浓度0.5％酪蛋白水解物，质量百分浓度0.5％山梨醇和质量浓度为100μg/mL的遗传霉素。