[发明专利]一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)将E型产气荚膜梭菌菌种接种于无菌血平皿培养基上，厌氧培养，进行菌株的复苏；(2)将复苏后的E型产气荚膜梭菌菌种接种于液体硫乙醇酸盐流体培养基中，厌氧条件下进行増菌，制得种子液；(3)将种子液接种于产毒培养基中，厌氧培养，制备得到外毒素液；(4)将制备的外毒素液经灭活、乳化处理，再加入硫柳汞，即制备得到E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。本发明开发制备了免疫力强，无毒副作用的E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。该疫苗可以有效预防由此菌导致的犊牛，羔羊痢疾等疾病。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。

背景技术

产气荚膜梭菌，旧称魏氏梭菌，根据其产生的4种主要外毒素(α，β，ε，ι)，将产气荚膜梭菌分为A，B，C，D，E五个毒素型型。Bohenel指出：“魏氏梭菌致病是由于它们形成分泌的毒素和代谢产物，无毒素产生就不会出现临床症状”。作为该菌成员之一的E型产气荚膜梭菌主要分泌α和ι外毒素。尽管在动物生产中很少有典型症状有关E型产气荚膜梭菌病，仍然有报告指出E型产气荚膜梭菌占到所有产气荚膜梭菌分离株的5％，同时5％的E型产气荚膜梭菌能与50％的牛致死性溶血性肠炎有关。并且E型产气荚膜梭菌主要侵袭羔羊，犊牛等反刍动物。20世纪初，在英国，报道了犊牛和羔羊的ι毒素肠毒血症的发生，在那时已经有报道一定数量的牛溶血性，坏死性肠炎即痢疾的发生，并且从发病的绵羊和牛也检测到了E型菌株和ι毒素。在巴西，E型产气荚膜梭菌在分离的菌株中占比比较大，在健康和腹泻的牛中接近30％的样品携带有ι毒素，其中有9％的牛会发生猝死。同时E型菌也可以感染多个物种，从具有肠毒血症临床症状的山羊，鹿，野猪中，也分离到了E型产气荚膜梭菌菌株。因此，为了预防E型产气荚膜梭菌对犊牛、羔羊的潜在危害，有必要对E型产气荚膜梭菌的疫苗进行研究。

产气荚膜梭菌形成的主要外毒素的化学成分为蛋白质，具有较好的免疫原性。因此，根据产气荚膜梭菌的发病机理，制备不同类别的产气荚膜梭菌毒素，将其灭活后做成类毒素疫苗，用于畜禽预防和治疗，能够达到确实可靠的免疫和治疗效果。目前已有关于A型-D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗制备的报道，但关于E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备，迄今仍未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)将E型产气荚膜梭菌菌种接种于无菌血平皿培养基上，厌氧培养，进行菌株的复苏；

(2)将复苏后的E型产气荚膜梭菌菌种接种于液体硫乙醇酸盐流体培养基中，厌氧条件下进行増菌，制得种子液；

(3)将种子液接种于产毒培养基中，厌氧培养，过滤除菌，制备得到外毒素液；

(4)将制备的外毒素液经灭活、乳化处理，再加入硫柳汞，即制备得到E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。

优选的，步骤(1)中，所述E型产气荚膜梭菌菌种采用的标准菌种E型NCTC8084(National Collection of Type Cultures，英国微生物菌种保藏中心)。该菌株可通过现有技术中的常规渠道直接获得。该菌株经多次试验，与其他E型产气荚膜梭菌菌株相比，产毒效果最佳。

优选的，步骤(1)中，所述无菌血平皿培养基由如下方法制备而成：

将3.8g血琼脂基础，1g葡萄糖，溶于100mL的去离子水中，121℃，15min高压灭菌，冷却至50℃，加入5mL脱纤维绵羊血，摇晃均匀，倾入灭菌的平皿，即得。

优选的，步骤(1)中，厌氧培养的温度为37℃，厌氧培养的时间为36h。