[发明专利]一种检测氯喹含量的酶联免疫试剂盒

说明书

本发明为检测氯喹的ELISA试剂盒的制备及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被了氯喹抗原的酶标板、氯喹标准品、氯喹抗体工作液、氯喹酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩样品稀释液和浓缩洗涤液。氯喹检测试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里将会出现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中氯喹的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测饲料、动物组织中的氯喹含量。

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，特别是检测氯喹的酶联免疫试剂盒。

背景技术

氯喹在人体内代谢较慢，含量超过一定量时易引起食欲减退、恶心呕吐、腹泻等反应；还可出现皮肤瘙痒、紫癜、脱毛、毛发变白，湿疹和剥脱性皮炎、牛皮癣；头重、头痛、头昏、耳鸣、眩晕、倦怠、睡眠障碍、精神错乱、视野缩小、角膜及视网膜变性等。

目前，氯喹的测定方法主要有高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法等，其检测结果准确可靠，但仪器设备比较昂贵，且样本前处理过程相对复杂。酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于农产品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测氯喹的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测氯喹的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测氯喹的酶联免疫试剂盒，包括氯喹酶标板、氯喹标准品、氯喹抗体工作液、氯喹酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测氯喹的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、氯喹标准品的制备、氯喹抗体工作液的制备、氯喹酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

氯喹包被抗原是将氯喹半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将氯喹抗原稀释成1：10000比例，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

氯喹标准品浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL、40.5ng/mL。

氯喹抗体工作液是采用氯喹人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：40000比例制备。

氯喹酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1：5000比例；底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；终止液为2mol/L的硫酸；浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

氯喹的ELISA试剂盒的检测方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20~25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有氯喹抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中；