[发明专利]一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测技术领域，尤其涉及DNA检测材料，具体为一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒。本发明的产物适用于检测人类肿瘤的KRAS/NRAS/BRAF的基因突变。

背景技术

研究表明，癌症是环境因素与细胞遗传物质相互作用的结果，是多因素、多阶段与多基因作用的结果，是基因突变累积的结果，因此癌症是基因病。在人类众多的基因中，原癌基因和抑癌基因与癌症的发生发展密切相关。原癌基因和/或抑癌基因的突变可引起细胞癌变。癌症在形成实性肿块以前，与癌症相关的基因突变的过程已经发生，而且这个过程可能已长达十余年、甚至更长时间。在这期间，癌细胞还没有形成明显的肿块，但已有微量肿瘤DNA释放到循环血液中。通过测序，PCR等基因检测技术检测循环血液中这些基因的突变，可以筛查早期或超早期癌症，评估放化疗的疗效，预测靶向药物的疗效，监测术后早期复发等；对肿瘤组织进行基因突变检测，有助于了解肿瘤的产生、发展过程，判断肿瘤的类型和预后；有助于预测原癌基因相关抗肿瘤药物的疗效。基因突变常表现为杂合突变、缺失或插入突变等，突变检测对测序的质量要求很高。通过应用基因分析仪进行突变分析，可准确判断出杂合、缺失、插入突变等各种突变类型，结果准确客观。

结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是常见的消化道肿瘤之一，近年来应用基因检测的方法判断CRC预后及指导基因靶向治疗已成为重要手段。其中RAS基因是表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信号通路中的关键性靶点，在CRC演变过程中发挥了重要作用。抗EGFR抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)主要与内源性配体竞争性结合EGFR，阻断下游的RAS信号通路产生抗肿瘤效应。研究显示只有携带RAS野生型的CRC患者才能从抗EGFR治疗中获益。因此KRAS基因突变状态成为预示CRC患者能否从抗EGFR治疗中获益的有效指标，但是仍然有一部分KRAS野生型基因携带者无法从抗EGFR治疗中获益，这表明在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和PI3-KAKT-mTOR信号传导通路中存在的其他突变基因(例如NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN基因突变)可能导致CRC患者无法从抗EGFR治疗中获益，因此，研究CRC中KRAS/NRAS/BRAF基因突变情况，将对临床治疗具有重要意义。可以明确中国人群KRAS、NRAS和BRAF基因的突变特征，指导临床CRC的个体化治疗，为选择合适的临床治疗方案提供依据。目前用于临床的肿瘤基因突变检测技术主要有ARMS-PCR技术，一代测序技术，二代测序技术，数字PCR技术等。

ARMS-PCR(AmplificationRefractoryMutationSystem)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从引物的3’末端开始，而引物3’末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对(A-T，G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。常规的ARMS-PCR技术操作简便，检测时间较短，检测灵敏度一般在1％左右，在检测血液样本时，敏感性较低，检出率明显低于相应的肿瘤组织样本，同时检测通量也不如测序方法。

测序技术是对核酸的序列直接进行测定来检测基因突变的情况，测序技术近年来发展迅速，从第一代的sanger测序法，到第二代高量测序，再到最新一代的单分子测序，检测通量及灵敏度有了大幅提高。Sanger测序法利用在DNA合成反应体系中，混入一定比例带有同位素标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，使DNA合成延伸终止在不同的核苷酸上，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和显影获得待测DNA的碱基序列。二代测序技术又称为高通量测序技术，各家公司的测序技术原理有一定差异。高通量测序一次能够并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，测序深度远高于一代测序技术，但测序的片段长度较短。但高通量测序的检测过程繁琐，耗时需要几天，成本也较高。