[发明专利]一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法

说明书

一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL‑60的方法，用人类急性白血病细胞株HL‑60为模型，参附注射液25.50μL/mL,高乌甲素100μL/mL，亚砷酸钠15μmol/L；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标。经药物处理60h后HL‑60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL‑60细胞NBT还原能力增强，药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。

技术领域

本发明涉及一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法，具体地说是以一种参附高乌甲素诱导白血病细胞株HL-60的方法。

背景技术

目前公知的中医药抗肿瘤研究领域根据《内经》“积之始生，得寒乃生，厥乃成积”、“阳化气，阴成形”的理论，逐步重视温阳法的研究。

发明内容

材料与方法 1、主要药物 参附注射液每毫升相当于生药红参0.1g,附片0.2g，由雅安三九药业有限公司生产（批号：20043116）；氢溴酸高乌甲素注射液（2mg/mL，由广州天心药业股份有限公司生产 ，批号：040501）；亚砷酸氯化钠注射液由哈尔滨伊达药业有限公司生产（批号：20050302）。以上药物均购自广东省中医院药房，临用时以磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释。2、主要试剂；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）均由Sigma公司生产；Wright-Giemsa混合染液由广州人仁公司提供；佛波酯（TPA）由Clbiochem公司生产；硝基四氮唑蓝（NBT）由Mbchem公司生产；碘化丙啶（PI）染色液由Becton Dickinson公司生产。 3、主要仪器；Bio-Rad-450型全自动酶标仪为美国Bio-Rad公司产品；150-400型细胞培养箱为英国Biotech公司产品；3169型倒置显微镜为日本Nikon公司产品；SW-CJ-IF型超净工作台为苏州净化设备厂产品；TGL-16型高速冷冻离心机为德国Sigma公司产品；NexPower1000型纯水器为韩国Human Corp产品； FACSCalibur型流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品；普利生MIAS 2000型智能骨髓图像分析系统为北京—深圳普利生公司产品；Nikon E200型普通光学显微镜为日本Nikon公司产品。4、细胞模型；HL-60细胞株购自中山大学动物中心细胞库，在广州中医药大学基础医学院生化教研室实验室传代培养。实验时取对数生长期细胞， 2g/L台盼蓝拒染实验证实活细胞数大于95%，并调整实验时所需密度。5、实验方法和检测指标；分组；设参附注射液、氢溴酸高乌甲素注射液实验组（简称参附液组、高乌甲素组），在实验的不同阶段，参附液组终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL，高乌甲素组终浓度分别为25、50、100μL/mL，亚砷酸钠对照组则取0.25、2、15μmol/L 3个浓度。并设空白（本底）对照组、阴性对照组。细胞加药培养；在实验的不同阶段，按相应的设计要求接种制备好的细胞悬液到12或96孔培养板中（每孔细胞量见具体项目），分别加培养基及药物。96孔培养板中每孔加含体积分数为15%小牛血清的RPMI-1640培养基180μL，然后按不同浓度加药，最后不足200μL的孔则用PBS补足至每孔总体积为200μL；12孔培养板中每孔加含体积分数为15%小牛血清的RPMI-1640培养基至终体积2.5mL,再按不同浓度加药。然后分别置入37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度条件下的细胞培养箱培养。每天将接种好的培养板取出置于倒置显微镜下观察1～2次，以及时掌握细胞生长状况。不同药物及浓度对HL-60细胞生长的影响；参附液、高乌甲素各设3个不同的药物浓度组，以细胞终浓度为2×104/mL接种到96孔培养板中，培养48h后采用MTT法检测各组存活率、半数抑制浓度（IC50）。细胞增殖抑制的MTT测定：加药培养后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，在细胞培养箱孵育4h后取出，用1.5mL离心管离心去上清，每管加DMSO 150μL，按原顺序放回96孔板轻轻震荡15min,采用酶标仪在570nm波长下测定各孔D值，根据下列公式计算细胞存活率：p细胞存活=（D加药组/D对照组）×100%。不同作用时间对HL-60细胞生长的影响；参考1.5.3的结果，取96孔板接种细胞。高乌甲素组设终浓度为50μL/mL，参附液组设终浓度为50μL/mL，细胞终浓度为2×104/mL，分别在培养24、48、72h取出相应培养板，按上法进行MTT检测。计算各组存活率，绘制生长曲线。细胞形态观察；进行1.5.3、1.5.4指标检测时每天将接种好的培养板取出，置于倒置显微镜下观察细胞生长状况1～2次。12孔板中每孔接种2×105个细胞培养60h后用PBS漂洗2次后，以体积分数为70%的乙醇将细胞固定后收集固定细胞涂片，吹干， Wright-Giemsa混合染液及甲基绿—派诺宁染色，晾干后普通光学显微镜下，观察200个细胞进行分类计数，智能骨髓图像分析系统拍照记录。NBT实验（还原反应比色法）；以每孔3×103个细胞接种到96孔板中培养5d后，1 000r/min离心5min收集细胞，再将细胞悬浮于200μL /孔的NBT溶液中（内含0.24μg/mL的TPA），放入培养箱中培养1h，细胞离心去上清液，每孔加入200μLDMSO，室温下震荡20min，在570nm波长下测定D值。流式细胞仪检测细胞周期分布、凋亡率；12孔板中每孔接种2×105个细胞培养60h，用PBS漂洗2次，调整细胞至1×106个/mL，再加体积分数为70%的乙醇（-20℃ ）固定细胞过夜后，上流式细胞仪以PI单染法检测细胞周期分布、凋亡率。统计学处理 采用Microsoft Excel软件进行统计分析。