[发明专利]一种黑色素瘤抗原A3杀伤人肝癌细胞的方法

说明书

一种黑色素瘤抗原A3杀伤人肝癌细胞的方法，采用粒—巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）和白介素4（interleukin4，IL4）从人外周血中诱导树突状细胞，经MAGEA3抗原致敏后与T淋巴细胞共培养，以淋巴细胞为效应细胞，分别以表达MAGEA3抗原的肝癌细胞株H4M、不表达MAGEA3抗原的正常肝细胞为靶细胞，收集T淋巴细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。

技术领域

本发明涉及一种黑色素瘤抗原A3杀伤人肝癌细胞的方法，具体地说是以一种黑色素瘤抗原A3杀伤人肝癌细胞的方法。

背景技术

目前公知的人黑色素瘤抗原A3（melanomaantigengene，MAGEA3）在多种肿瘤组织中表达，而且在肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）中也有较高频率的表达，但在正常组织中除胎盘和睾丸外均不表达，因此在抗肿瘤免疫治疗中是理想的靶抗原。树突状细胞（dendriticcells，DCs）是体内唯一能激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞，DCs在诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应中具有特别重要的作用。

发明内容

材料与方法；质粒与细胞株含MAGEA3cDNA的重组质粒pGEX4T1MAGEA3为本室自行构建。肝癌细胞株H4M及正常肝细胞株L02由中山大学第一附属医院病理科原代培养建株。主要试剂RPMI1640培养基购自Gibcobrl公司；胎牛血清购自Hyclone公司；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD80、CD86单克隆抗体及藻红蛋白（PE）标记的小鼠抗人CD83、人类白细胞抗原DR单克隆抗体均购自Pharmingen公司；兔抗人MAGEA3多克隆抗体购自NeoMarkers公司。MAGEA3蛋白的分离与纯化重组质粒pGEX4T1MAGEA3转化大肠杆菌BL21，经异丙基硫化βD半乳糖苷（IPTG）诱导表达。取1000mL诱导表达的菌液，10000g、4℃离心5min；菌体沉淀用50mL磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）重悬，冰浴，超声裂解细菌，加入TritonX100至终体积分数为1%，混匀，冰浴放置30min；12000g、4℃离心20min；取上清液，采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳用5 mL谷胱苷肽硫转移酶（glutathinStransferase，GST）层析柱分离融合蛋白，经SDSPAGE及凝胶薄层扫描鉴定纯化蛋白的纯度；PBS透析24h，过滤除菌，-70℃保存。DCs的体外培养及抗原致敏采用Ficoll常规分离5名正常献血员外周血获得单个核细胞，调整其细胞密度为2×106／mL，加1mL于24孔板中，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养3h后，吸去悬浮细胞，加入DCs培养基（含rhGMCSF100ng/mL、rhIL450ng/mL的RPMI1640），在37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养，每3d换液1次。通过倒置显微镜观察DCs树突状外形，同时采用流式细胞仪检测DCs表面HLADR、CD80、CD83、CD86的表达。收集第7天的DCs，调整细胞浓度为3×106个/mL，接种于24孔板中，分别加入GSTMAGEA3蛋白（20μg/mL）50、100、200、300μL，GST蛋白（20μg/mL）100μL和PBS100μL培养24h；加入TNFα(50U/mL)，继续培养2d。细胞株的培养分别传代培养正常肝细胞株L02和肝癌细胞株H4M；将细胞悬液（浓度为1×105个/mL）制成爬片，免疫组化染色检测MAGEA3蛋白的表达。T淋巴细胞的制备及CTL的体外诱导取同1个体外周血，Ficoll常规分离单个核细胞，用培养液调整其细胞密度为1×106/mL；按照淋巴细胞与DCs细胞数量比为5∶1的比例混合培养后，分以下几组：A组为未与DCs混合培养的淋巴细胞（空白对照组）；B组为淋巴细胞+DCs（未负载融合蛋白，以PBS替代）；C组为淋巴细胞+DCs（负载20μg/mL融合蛋白50μL）；D组为淋巴细胞+DCs（负载20μg/mL融合蛋白100μL）；E组为淋巴细胞+DCs（负载20μg/mL融合蛋白200μL）；F组为淋巴细胞+DCs（负载20μg/mL融合蛋白300μL）；G组为淋巴细胞+DCs（负载20μg/mLGST蛋白100μL）。每3d半量换液，补充PHA和rhIL2，以促进DCs的成熟，增强DCs的抗原提呈能力；于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养7d，实验终止前4h，每孔加入新鲜配制的5mg/mL的MTT20μL，倒置显微镜下观察；1000r/min离心5min，去上清液，每孔加入DMSO150μL，振荡5min，于酶标仪上570nm处读取吸光度(D)值，按下列公式计算刺激指数：Is=D实验组/D空白对照组。然后，调整淋巴细胞与DCs细胞数量比分别为10∶1、20∶1、50∶1、100∶1，同样按照上述A至G的分组重复以上实验步骤，以比较不同组淋巴细胞的增殖能力，每组计数3次，取平均值。以未与DCs混合培养的淋巴细胞作为空白对照。CTL的杀伤效应以培养第7天的淋巴细胞为效应细胞，以MAGEA3阳性的H4M肝癌细胞为靶细胞，按效靶比（细胞数量比）为10∶1，在以下各组中同时加入淋巴细胞和靶细胞进行杀伤实验，其中靶细胞为2×104个/孔，效应细胞做相应调整；每组另设3个复孔，以PBS为空白对照，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱孵育48h。分组如下：Ⅰ组为肝癌细胞+经负载GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴细胞；Ⅱ组为肝癌细胞+经负载GST蛋白的DCs刺激的淋巴细胞；Ⅲ组为肝癌细胞+未负载GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴细胞；Ⅳ组为肝癌细胞+未经DCs刺激的淋巴细胞；Ⅴ组为淋巴细胞（效应细胞）；Ⅵ组为肝癌细胞（靶细胞）；以MAGEA3阴性的正常肝细胞L02为靶细胞，重复上述实验分组。然后，调整效靶比分别为20∶1、50∶1、100∶1，同样按照上述Ⅰ至Ⅵ的分组重复以上实验步骤，以比较不同效靶比情况下的CTL的杀伤效应。MTT法检测淋巴细胞的杀伤活性在结束培养前4h吸弃上清，加入新鲜配置的MTT（5mg/mL）20μL/孔，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱孵育4h；弃上清，加入DMSO150μL/孔，室温下振荡至结晶物溶解；在酶标检测仪上，用空白对照孔调零后测各孔D570值，对于D＜0者按照0值计算，计算杀伤率：p杀伤/%＝［Ｄ靶细胞-(D效靶细胞-D效应细胞)］/D靶细胞×100%。统计学处理使用统计软件SPSS100完成。