[发明专利]一种大黄鱼的抗氧化反应指示物

说明书

技术领域

本发明涉及反应指示物领域，尤其是涉及一种大黄鱼的抗氧化反应指示物。

技术背景

氧化应激产生的活性氧ROS（reactive oxygen species）直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理基础。机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统，当暴露于亲电子试剂或活性氧刺激时，能诱导出一系列的保护性蛋白，以缓解细胞所受的损害。NF-E2相关因子2（NF-E2-related nuclear factor 2，Nrf2）在细胞抗氧化反应中发挥重要作用。正常生理状态下，Nrf2与Kelch 样ECH 相关蛋白1（Kelch-like-ECH-associated protein 1，Keap1）大量结合并在细胞质中快速降解。一旦细胞受到应激，Nrf2与Keap1分离，进入细胞核中调控抗氧化酶相关基因的表达。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的用途，大黄鱼的抗氧化反应指示物有助于考察海水中的重金属污染情况，具有较高的现实意义。

本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的确定方法，本抗氧化反应指示物的确定方法较为简单，精确度较高。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，大黄鱼中Nrf2转录因子的表达与Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx1a、GPx1b和GR的基因表达水平存在正相关，Nrf2转录因子的表达与Nrf2的蛋白含量也存在正相关，因此，Nrf2的mRNA丰度和蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物，这有助于人们了解水中重金属离子对鱼的抗氧化反应的分子机制，进而有助于通过大黄鱼来考察海水中的重金属污染物，因此具有较高的现实意义。

作为优选，确定Nrf2的mRNA丰度和蛋白含量作为大黄鱼抗氧化反应指示物的方法包括：驯化大黄鱼、提取肝脏物质、RT-PCR实时荧光定量检测，具体包括以下步骤：

驯化大黄鱼：将大黄鱼在圆形玻璃缸中圈养15-20天，每天2-3次投喂商业饲料，饲料中脂质与蛋白质的干物含量分别为10-11%与48-50%，选取135条均一尺寸、重量为86-92g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，玻璃缸连续曝气，每天换水，每天维持14-15小时光照、9-10小时黑暗，水质参数如下：水温20-28℃，盐度25.5-26.5、溶氧量6.8-7.2mg/L，pH值为7.52-8.04，水质硬度为碳酸钙浓度120-125mg/L；将HgCl₂加入到养殖水缸中配成含Hg溶液，Hg的含量分别为32、64μg Hg L^-1，取暴露在含Hg溶液中的大黄鱼浸泡在苯佐卡因中被麻醉过量致死，取肝脏样本待用；经测定，大黄鱼在急性无机汞环境下暴露96小时的半数致死率（LC₅₀）为160μg Hg L^-1，在大黄鱼的拟生长环境下进行检测不仅可以精细化地测定抗氧化反应指示物的特异性，而且基于人道主义考虑，同时保护了生态；

提取肝脏物质：肝脏样本被均质到10-15倍的冰冷的缓冲液中，缓冲液组成为：1.0-1.2mMEDTA、1.0-1.2mMDTT、0.5-0.6M蔗糖溶液、0.15-0.18MKCl、0.13-0.15μM（S）-4-苄基-2-唑烷酮，pH为7.6-7.8；肝脏匀浆在0-4℃下以900-1000g离心8-10分钟以沉淀大粒子，然后再次在0-4℃下以12000-14000g离心15-20分钟，收集漂浮物并于-80~-100℃保存以供生化分析；通过肝脏组织可以对铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶1a（GPx1a）、谷胱甘肽过氧化物酶1b（GPx1b）和谷胱甘肽还原酶（GR）等抗氧化酶的酶活性进行定量检测；缓冲液中的（S）-4-苄基-2-唑烷酮能够与肝脏组织中的铅离子、铜离子、汞离子等二价重金属离子形成络合物，将重金属离子从组织中分离入溶液中，同时缓冲液还可以分离肝脏样本中无用的脂肪、杂蛋白等杂质，不会对肝脏组织中各抗氧化酶与总RNA造成分解与影响，提高检测的精确度；