[发明专利]一种双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

双酚S(Bis S)化学名为4，4-二羟基二苯砜，是一种重要的农药、染料、助剂的中间体，可以作为聚碳酸酯、环氧树脂、聚酯树脂、聚砜和聚醚砜的原料。被广泛用于禁止或限制双酚A使用的日常用具的制造，如食品包装材料、食品罐内衬、奶瓶和纸制品等。

随着人们对食品安全问题的关注度不断上升，在曝出双酚A的诸多问题后，许多塑料制品厂家开始用双酚S取代双酚A。但双酚S与双酚A结构相似，同属于环境雌激素类物质，可以通过包装材料迁移至食品中，对人体产生潜在危害，能影响生物体内的雌性激素，摄入过多会导致内分泌失调，同时双酚S还会导致新陈代谢紊乱从而引发肥胖。还有研究显示双酚S对淋巴细胞具有增值作用，当双酚S的浓度为2～20mg/L时，促进作用最为显著。

目前关于双酚类化合物检测方法还不成熟，需要建立一种灵敏度高的检测方法来监测双酚类化合物在食品包装材料的应用及食品中的迁移量分析。因此建立快速简便的双酚S检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

发明内容

本发明的目的首先是提供一株双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14686，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。由该细胞株制备的抗体对双酚S具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立双酚S的免疫学检测方法。

本发明的第二个目的在于提供一种双酚S单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.14686的双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。

所述双酚S单克隆抗体的应用，用于食品接触材料检测中双酚S迁移量的分析检测。

本发明的第三个目的在于提供制备所述双酚S免疫原的方法，主要包括以下步骤：

1)合成半抗原Bis S：将4，4’-二羟基二苯砜完全溶解后，加入氢氧化钠固体，加热回流后加入4-溴丁酸甲酯，继续反应后调节pH值约3-4，TLC监测，出现少量二取代产物后淬灭反应；加入饱和食盐水充分振荡后静置分层，分去水相，有机相用无水硫酸钠干燥，静置一段时间后，过滤除掉硫酸钠，减压蒸去溶剂，粗产物经过柱色谱分离得到纯净的产物a；

将化合物a溶解，在搅拌下按比例加入KOH溶液，室温搅拌后调节反应体系pH值约为3，淬灭反应；加入饱和食盐水充分振荡后静置分层，分去水相，有机相用无水硫酸钠干燥，静置一段时间后，过滤除掉硫酸钠，减压蒸去溶剂，粗产物经过柱色谱分离得到纯净的产物b，即半抗原Bis S。

2)完全抗原的制备：

免疫原Bis S-KLH的制备：称取半抗原Bis S，1-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解得到A液；取钥孔血蓝蛋白KLH，用硼酸缓冲溶液溶解得到B液，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物Bis S-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原Bis S-KLH。

本发明的第四个目的在于提供制备所述双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，主要包括以下步骤：

(1)小鼠的免疫：将免疫原Bis S-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用Bis S-KLH完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制；

(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株；

(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。