[发明专利]一种构建重组酿酒酵母高效合成葡聚糖的方法

说明书

本发明公开了一种构建重组酿酒酵母高效合成葡聚糖的方法，属于生物医药领域。本发明通过调控葡聚糖合酶以及相关基因的表达量和底物水平来获得高产β‑D‑葡聚糖的酿酒酵母菌株。本发明的重组菌，通过表达FKS1、GSC2、RHO1、KRE5、KRE6等基因，使β‑D‑葡聚糖的含量得到显著提升，其中表达FKS1、RHO1的重组菌的β‑D‑葡聚糖产量分别提高了67％、55％，另外，同时表达FKS1、GSC2、RHO1这三个基因的重组菌的β‑D‑葡聚糖产量提高了299％。

技术领域

本发明涉及一种构建重组酿酒酵母高效合成葡聚糖的方法，属于生物医药领域。

背景技术

酵母细胞壁85-90％是多糖，10-13％为蛋白质，另外还含有少量脂肪等物质。酵母细胞壁多糖的组分为水溶性甘露糖、碱溶和碱不溶性β-D-葡聚糖、少量的几丁质等组成。酵母β-D-葡聚糖是以β-1,3-葡聚糖为主，β-1,6-葡聚糖为辅的一种混合多糖。

酵母β-D-葡聚糖能与动物及人类的免疫细胞，包括单细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞发生特异性结合，增强宿主细胞免疫功能。此外，酵母β-D-葡聚糖还有抗肿瘤、增强机体抗辐射、降低胆固醇和血脂等功效。

目前，国内外β-D-葡聚糖功能产品的开发已经成为热点，而国内生产酵母β-D-葡聚糖公司的生产能力无法满足市场要求，β-D-葡聚糖产品有着极好的市场前景。针对目前β-D-葡聚糖的提取工艺，提取率低。所以提高酿酒酵母中β-D-葡聚糖的合成量，可以降低β-D-葡聚糖的生产成本，增加β-D-葡聚糖的产量是非常有必要的。

目前已有的报道中，增加β-D-葡聚糖的产量的方法有培养基优化和诱变育种两种。在培养基优化的方法中，通过单因素试验研究了碳源、氮源、无机离子、酶激活剂对β-D-葡聚糖的产量的影响，建立数学模型，通过响应面分析得到最优的培养基组分。诱变育种的方法有紫外诱变、等离子诱变等方法，以获得高产菌株。这两种方法在提高β-D-葡聚糖的产量上效果不够明显，尤其是培养基优化的方法，提高的产量很低。另外，诱变育种的方法需要耗费大量时间筛选有用菌株，而且具有一定的盲目性。

发明内容

本发明的目的是通过改造酿酒酵母，以提高酿酒酵母细胞壁葡聚糖的产量。通过调控β-葡聚糖合酶以及相关基因的表达量和底物水平来获得高产β-D-葡聚糖的酿酒酵母菌株。

本发明的第一个目的是提供一种葡聚糖产量提高的酿酒酵母重组菌，所述酿酒酵母重组菌表达了葡聚糖合成途径的相关基因。

在本发明的一种实施方式中，所述葡聚糖为含有β-1,3和β-1,6糖苷键的β-葡聚糖。

在本发明的一种实施方式中，所述葡聚糖合成途径的相关基因，为以下任意一种或者多种：编码前体物质积累的相关酶的基因、编码β-1,3-葡聚糖合酶重要组成亚基FKS1和GSC2的基因、编码β-1,6-葡聚糖合成途径酶的基因、编码β-1,3/1,6-葡聚糖合成途径的调控亚基的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母重组菌过表达了以下的一种或者两种以上的基因：FKS1(β-1,3-葡聚糖合酶亚基1)、GSC2(β-1,3-葡聚糖合酶亚基2)、RHO1(β-1,3/1,6-葡聚糖合成调控亚基)、KRE5(K5细胞毒素抗性基因)、KRE6(K6细胞毒素抗性基因)。

在本发明的一种实施方式中，所述基因是采用质粒游离表达或者整合表达。

在本发明的一种实施方式中，所述基因FKS1和GSC2为编码β-1,3-葡聚糖合酶重要组成亚基的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因RHO1为编码β-1,3/1,6-葡聚糖合成途径的调控亚基的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因KRE5、KRE6为编码酵母细胞壁中β-1,6-葡聚糖合成的关键酶基因。