[发明专利]一种基于转录组测序开发鬼针草植物SSR引物的方法

说明书

本发明公开一种基于转录组测序开发鬼针草植物SSR引物的方法，包括如下步骤：(1)转录组数据的获得；(2)SSR引物的识别(3)SSR引物的设计；本发明的28对SSR引物是通过来源于鬼针草属6个种和鬼针草种中9个不同地理区域居群筛选得到，在15个鬼针草物种中均具有多态性，可以直接将本发明所提供的28个引物对应用于更多鬼针草品种上，进行种质资源和遗传多样性分析，为鬼针草分子标记辅助育种奠定了良好的基础。

技术领域

本发明涉及一种基于转录组测序开发鬼针草植物SSR引物的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

鬼针草（Bidens bipinnata L.）属于菊科鬼针草属植物，又名刺针草、婆婆针。一年生草本，茎直立，高30~120 cm。生于路边荒地、山坡及田间，广布全国，全草入药，是一种重要的药用植物。可以清热、解毒、散瘀，被用于医治痢疾、腹泻、肝炎等疾病，同时也对心脑血管疾病、肿瘤具有一定疗效。由于，鬼针草属植物在我国南北均有分布，生态适应幅度大，形态上产生很多变异，导致鬼针草与同属的一些近缘种很难区分。同种异名、同名异种现象普遍存在，无法反映真实的亲缘关系和遗传特性，为确保鬼针草的正确和安全用药，对鬼针草及其近缘种进行一些分子标记的研究，以找到快速准确鉴定鬼针草的方法是非常必要的。

随着现代生物技术的发展，分子标记已经被广泛用于药材鉴别、种质资源遗传多样性分析以及辅助育种工作中。简 单 重 复 序 列 （simple sequence repeats，SSR）又称微卫星，其可直接反映遗传多样性，具有稳定性好、通用性强和多态性高等优点，被广泛应用于比较基因组学、遗传多样性分析、进化研究以及分子育种等方面。

目前，鬼针草尚无全基因组序列信息，关于其SSR引物数量非常有限。对于无参考基因组的物种来说，采用高通量测序技术对其转录组进行分析，将测序所得的序列拼接成转录本，以转录本作为参考序列，进行后续分析。因此，利用第二代高通量测序技术获得鬼针草转录组序列信息，批量开发EST-SSR引物，将会对鬼针草属植物种质资源鉴定、遗传多样性、重要性状基因定位及分子标记辅助选择育种等起重要推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于转录组测序开发鬼针草植物SSR引物的方法,为了实现本发明目的，本发明的一种基于转录组测序开发鬼针草SSR引物的方法， 所述方法包括以下步骤 ：

（1）转录组数据的获得

利用Trizol试剂提取鬼针草幼苗地上和地下部位的总RNA， 用带有Oligo(dT)磁珠富集mRNA；随后加入 fragmentation buffer 将 mRNA 打断成短片段，以 mRNA 为模板，用六碱基随机引物(random hexamers) 合成第一链 cDNA ，然后加入缓冲液、dNTPs 和DNA polymerase I 和 RNase H 合成第二链 cDNA ，再用 AMPure XP beads 纯化双链cDNA ；纯化的双链cDNA 先进行末端修复、加 A 尾并连接测序接头，再用 AMPure XPbeads 进行片段大小选择；最后进行 PCR 扩增，并用 AMPure XP beads 纯化 PCR 产物，得到最终的文库；文库构建完成后，先使用 Qubit2.0 进行初步定量，稀释文库至 1.5ng/ul ，随后使用 Agilent 2100 对文库的 insert size 进行检测， insert size 符合预期后，使用 Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量 ( 文库有效浓度＞ 2nM) ，以保证文库质量；构建好的测序文库用IlluminaHiseq 2000进行测序；

（2）SSR引物的识别