[发明专利]用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,包括碱基的置换/插入和缺失等形式。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析/关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。较常见的单碱基多态性位点的检测方法包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),三引物等位基因扩增法(TP-PCR)和测序等，这些方法虽各有优点,但也各有其不足之处。

CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术。PCR-RFLP是一种快速,简便,准确的检测SNP基因型的经典方法。其原理是：限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4-6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的置换、插入和缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。该方法的优点在于快速简单，终点判断准确。但其主要缺点在于酶切位点的选择，要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。PCR-RFLP酶的选择具有局限性，并不是所有的SNP位点都可以用这种方法来鉴别，且部分内切酶价格昂贵，实验成本高。三引物等位基因扩增法(TP-PCR)是一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法。反应体系中有2种模板和3种引物,从而在同一个反应体系中产生一个重组DNA分子。这种方法的主要优点是快速，不依赖连接片段的限制酶位点。但其缺点是扩增效率低，扩增特异性差，无法保证PCR产物的特异性和稳定性，分型结果易造成误判。Taqman荧光探针法是一种新型高效准确的基因分型方法，其优点是检测灵敏度高，分型准确。但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高。

胃癌(Gastric cancer，GC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年新发和死亡病例分别为40.5万和32.5万，约占全球胃癌新发和死亡病例的42.5％和45.0％。2012年全国癌症登记数据显示，胃癌的年龄标化发病率和死亡率分别位居我国恶性肿瘤发病和死因顺位的第2位和第3位，虽然两者近年均呈明显的下降趋势。但随着人口的增长和老龄化的加速，每年新发病例依然在增加。全球胃癌患者5年生存率不足25％。主要由于胃癌癌前病变和早期癌患者缺乏特异性症状，80％患者被诊断时已处于疾病进展期，虽然我国对进展期胃癌治疗水平显著提升，但胃癌的早期诊断率依然有待提高。

胃癌是基因和环境等多因素协同或序贯作用下，并在神经-内分泌-免疫调控下，对阶段进行性发展并具有高低特异性的全身性疾病。长链非编码基因间RNA(long intergenic non-protein coding RNA 520，LINC00520)其编码基因位于人类染色体14q22.3。LINC00520长约20kb,为高度保守的长链非编码RNA，在多种组织中广泛地表达。LINC00520是2012年新发现的基因，它与西班牙儿童肥胖具有相关性。LncRNA在不同癌症患者与健康者中的差异表达也预示着LncRNA可能与癌症的发生发展密切相关。LINC00520在由致癌PI3K转化的乳腺上皮细胞中增加，其表达增加依赖于突变PIK3CA的敲除。表达谱分析强调LINC00520在人类乳腺癌中升高，尤其在基底样乳腺癌中优先富集。研究表明ShRNA介导LINC00520的消耗阻止乳腺癌细胞的迁移LINC00520由致癌基因Src、PIK3CA和STAT3调节，可能有助于乳腺癌的分子病因学研究。2015年陈明政等研究表明LINC00520在细胞株HK-1中呈低表达，LINC00520在非鼻咽癌组表达水平高于鼻咽癌组。LINC00520在鼻咽癌与鼻咽良性疾病中表达水平的改变提示其差异表达与鼻咽癌的发生发展有关。近年来LINC00520在肿瘤领域的研究取得了较大进展，但其在胃癌领域的研究开展相对较少，因此将一定功能相关的LINC00520位点多态性与胃癌结合起来可以更好的探讨其对胃癌形成过程的作用，揭示其与胃癌发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。