[发明专利]克仑特罗ELISA检测试剂盒、其制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种克仑特罗ELISA检测试剂盒、其制备方法及其应用。

背景技术

克伦特罗（Clenbuterol）是一种强效β₂-肾上腺素受体激动剂，将其添加到饲料中，可促进动物生长，增加蛋白质的合成，提高家禽瘦肉比，但克伦特罗可在动物的可食性组织中蓄积致使食用者产生毒副作用，我国农业部做出规定，严格禁止在养殖业中使用克仑特罗，并要求加强对该物质在动物源性食品中的残留检测盒监督。目前测定克仑特罗残留的方法较多，有GC法、HPLC法、GC/MS法、LC-MS法，这些方法虽然检测灵敏度高、准确性好、结果稳定，并且部分方法具备即可定性又可定量等特点，但对于现场和基层单位的检测工作而言，也有诸多不足之处，如仪器设备昂贵，不适合于广泛应用；前处理操作繁琐，操作技术要求较高，检测周期比较长，且不能一次大批量进行样品的检测。

ELISA作为最常用的筛检克仑特罗残留的方法，与常规的化学、生物学的检测方法比较，具有检测时间短、操作简便、具有较高的灵敏度及较高的特异性的优点，并可用于一次大批量的进行检测。但目前国内生产使用的试剂存在着包被技术繁杂，成本相对较高订购周期较长的缺点。

因此开发出一种包被技术简洁、包板成本低、试剂盒制备周期短的产品用于检测动物源食品中盐酸克伦特罗残留，将具有非常广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种克仑特罗ELISA检测试剂盒、其制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术路线：

由于克仑特罗是小分子化合物，属于半抗原，本身只具有反应原性，不具备免疫原性，所以需与大分子载体蛋白进行偶联成完全抗原才能用酶联免疫法包被在酶标板上，传统酶标板包被方法使用湿法包被，需要过夜存放，在此基础上改变包被环境选择使用干法包被，可大大缩短包被时间。

具体技术方案如下：

设计一种克仑特罗ELISA检测试剂盒，包括包被的偶联克仑特罗的抗原蛋白。

所述的试剂盒的制备方法包括以下步骤：

（1）取亚硝酸钾溶于蒸馏水中配置成的亚硝酸钾溶液，调温度至0～5℃；

（2）以H₂SO₄溶解克仑特罗，水浴作用20 min；

（3）待上清液冷却，缓慢加入亚硝酸钾溶液并不断搅拌，静置反应；

（4）将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，冷却；

（5）将重氮化克仑特罗缓慢加入并不断搅拌，保持酸碱度稳定，过夜反应；

（6）用 PBS透析偶连后的产物直至透析液中检测不出任何小分子物质；

（7）将偶连后的产物以滤膜过滤，-20℃分装保存；

（8）取干净的酶标板，每孔加入克仑特罗完全抗原，干燥；

（9）每孔加入BSA封闭；

（10）用PBST反复洗涤；

（11）加入固定液固定，完全干燥后即得。

优选的，所述步骤（8）中的所述干燥温度为37℃。

优选的，所述步骤（11）中的所述干燥温度为37℃。

所述的试剂盒在食品安全检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1. 本发明使克仑特罗与大分子载体蛋白进行偶联成完全抗原，用竞争酶联免疫法包被在酶标板上，检测敏感度高，针对克仑特罗物质检测特异性强。

2. 本发明试剂用量少，使试剂盒制备过程大大简便易行，节约成本，使用简便，易于推广和应用。

3. 本发明改变包被环境选择使用干法包被，可大大缩短包被时间，酶标板制备耗时短，缩短试剂盒制作周期，节省大量时间。

附图说明

图1为干法包被与湿法包被检测OD值的比较图；

图2为各标准溶液的板内变异系数图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的检测方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：一种克仑特罗ELISA检测试剂盒的制备

详细操作步骤如下：

1. 取亚硝酸钾溶于蒸馏水中配置成0.2 M的亚硝酸钾溶液，以冰水浴调温度至0～5℃；