[发明专利]一种检测双肿瘤标志物光致电化学免疫传感器的构建方法

权利要求书

1.基于枝状二氧化钛纳米棒-钛酸锶(B-TiO₂ NRs-SrTiO₃)异质结同时特异性检测双肿瘤标志物的光致电化学(PEC)免疫传感器的制备方法，其特征包括以下步骤：

(1)5～20mL盐酸加入5～20mL超纯水中，室温搅拌10min，加入0.2～10mL钛酸四正丁酯溶液，继续搅拌30min得到混合溶液；掺杂氟的SnO₂透明导电玻璃依次在丙酮、乙醇、超纯水中各清洗10min，干燥后以导电面向下的方式放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将混合溶液转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的150℃烘箱内恒温反应30～300min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，放入真空干燥箱中60℃干燥8h，制备二氧化钛纳米棒；

(2)量取0～10mL盐酸加入盛有10～50mL超纯水的烧杯中，室温搅拌10min，加入0～10mL三氯化钛溶液，继续搅拌10min得到混合溶液；将二氧化钛纳米棒以导电面向上的方式放入混合溶液中，用保鲜膜封口烧杯，置于90℃烘箱中反应10～120min，反应完毕后，取出样品，用超纯水彻底冲洗3次，放入真空干燥箱中60℃干燥8h；最后，将样品放入500℃马弗炉中煅烧2h以提高制备的枝状二氧化钛纳米棒结晶度；

(3)称取0.05～0.5g钛酸锶加入盛有1～20mL超纯水的烧杯中，室温搅拌30min后，依次加入1～20mL一缩二乙二醇，1～20mL无水乙醇，1～20mL异丙醇，1～20mL氢氧化四丁铵水溶液，继续搅拌30min得到混合溶液并转移至高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将B-TiO₂ NRs以导电面向上的方式放入内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的160℃烘箱内恒温反应30～240min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水和乙醇分别清洗3次，最后将B-TiO₂ NRs-SrTiO₃异质结样品放入60℃真空干燥箱中干燥8h；

(4)10～40μL 0.5mg/mL壳聚糖滴加到B-TiO₂ NRs-SrTiO₃电极表面，室温孵育2h，用1MNaOH和超纯水分别清洗3次，10～40μL戊二醛滴加至电极表面，室温孵育30min，用超纯水彻底清洗3次，0～40μL含0.5mg/mL AFP Ab₁与0.5mg/mL CA 153 Ab₁混合溶液滴加到电极表面，在4℃下孵育16h，用pH 7.4 PBS彻底冲洗3次，继续滴涂10mL3％的牛血清白蛋白封堵非特异性结合位点，用pH 7.4 PBS彻底冲洗3次，10～40μL不同浓度AFP和CA 153混合抗原滴加至电极表面，37℃孵育30min，用pH 7.4 PBS洗涤3次，滴加10～40μL 0.25mg/mL生物素-AFP Ab₂，37℃孵育30min，用pH 7.4 PBS洗涤3次；然后，滴加10～40μL含0.2mg/mL链霉亲和素的0.01M pH 7.4 PBS溶液，37℃孵育60min，用pH 7.4 PBS洗涤3次，滴加10～40μL0.5mg/mL生物素-β-Gal，37℃孵育60min，用pH 7.4 PBS洗涤3次；滴加10～40μL 0.25mg/mL生物素-CA 153 Ab₂，37℃孵育60min，用pH 7.4 PBS洗涤3次，最后，滴加10～40μL 0.25mg/mL链霉亲和素-AChE，37℃孵育60min，用pH 7.4 PBS洗涤液彻底冲洗3次，PEC免疫传感器成功构建。