[发明专利]一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记与应用

权利要求书

1.一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记，其特征在于与NtHMA2野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与NtHMA2突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.2所示。

2.根据权利要求1所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记，其特征在于NtHMA2突变体为hma2-2h23突变体。

3.一种权利要求1或2所述鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的引物对，其特征在于包括第一轮PCR引物和第二轮PCR引物，其中，第一轮PCR引物为：

上游引物：HMA2-F：AATATAGAGATGGCCAATGAAGGT；

下游引物：HMA2-R：CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT；

第二轮PCR引物为：

上游引物：HMA2-2H23-dC1F：GATTGTGCGGTGGCTAGGATGGGA；

下游引物：HMA2-2H23-dC1R：CTTCTATGCTGGCAAGCTTCCGAAG。

4.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的应用，其特征在于所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记在利用突变体hma-2h23改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。

5.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）利用第一轮PCR引物对烟草基因组进行PCR扩增；

（2）第一轮PCR产物稀释2倍后利用第二轮PCR引物进行第二轮PCR扩增；

（3）第二轮PCR产物经纯化后利用BsmFI酶切，如果PCR产物能被BsmFI酶切，则为野生型；如果PCR产物不能被BsmFI酶切，则为突变体。

6.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于步骤（1）中所述的PCR扩增利用ExTaq进行（Takara），25µL体系，PCR体系包括以下成分：

ExTaq0.125µL

10x ExTaq Buffer(Mg2+ free)2.5µL

MgCl₂2µL

dNTP(2.5mM)2µL

基因组DNA0.5µL

上游引物HMA2-F（10µM） 0.5µL

下游引物HMA2-R（10µM） 0.5µL

灭菌超纯水 16.875 µL。

7.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于步骤（1）中所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 90s，32个循环； 72℃ 7min。

8.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于步骤（2）中所述的PCR扩增反应体系为50µL，包括以下成分：

ExTaq0.25µL

10x ExTaq Buffer(Mg2+ free)5µL

MgCl₂ 4µL

dNTP(2.5mM)4µL

第一轮PCR产物稀释2倍液 0.5µL

上游引物HMA2-2H23-DC1F 1µL

下游引物HMA2-2H23-DC1R 1µL

灭菌超纯水 34.25µL。

9.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于步骤（2）中所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃30s，72℃ 30s，32个循环；72℃ 7min。