[发明专利]具有生物安全性的病原菌样品前处理方法

说明书

本发明提供一种具有生物安全性的套管法微生物质谱检测试剂盒，涉及肽质量指纹图谱检测和微生物样品无害化处理技术领域。本发明试剂盒含有：试剂A：50～90％甲酸与80～100％乙腈等体积混合液；基质溶解液：1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液；基质：α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸及样本制备套管，该套管由上部滤膜管和下部收集管组成。使用时将微生物在上部滤膜管中经试剂A悬浮混匀，离心后收集管中的液体即为质谱上样前蛋白样本，常规方法对蛋白样本进行质谱检测。本发明的试剂盒处理的微生物样本安全性好，操作简单，适用于目前所有的基于MALDI‑TOF MS的微生物快速检测系统。

技术领域

本发明涉及基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI- TOF MS)的肽质量指纹图谱微生物鉴定技术和微生物样品无害化处理技术领域，具体地，涉及一种适用于MALDI-TOF MS检测的微生物样品具有生物安全性的快速前处理方法以及具有生物安全性的套管法微生物质谱检测试剂盒。

背景技术

病原体的快速、准确识别是临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全等公共卫生问题的关键因素。随着软电离技术的发展，基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)微生物识别技术也随之问世，该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物(小蛋白或多肽)形成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。目前该技术体系已经成熟，其快速、自动化、高通量、准确的特性已使其在全球临床诊断、质检、传染病监测、食品安全等领域占有一席之地，并迅速发展。商业化的质谱微生物鉴定系统继布鲁克及岛津公司之后，国内质谱研发及生产厂家正蓬勃发展，相应的仪器设备也不断地装备疾控、质检及临床检验系统。样本的快速前处理是保证快速、高通量鉴定的前提，目前没有用于样本快速处理的商业化试剂盒。确保生物安全性是病原微生物检测的前提，美国亚特兰大质谱炭疽检测的泄露事件已经向基于质谱的微生物检测的安全性敲响了警钟。目前全球范围内没有用于质谱微生物检测样本生物安全提取的商业化产品。

现有技术中基于质谱的微生物检测样本前处理方法有两种，一种是直接将未知菌落涂在样品靶上然后结合基质的直接菌落法；一种是采用乙醇/甲酸处理菌落的预提取法。第一种直接菌落法危险性非常高，与基质α-氰基-4-羟基肉桂酸结合并不能杀死所有的微生物，潜在危险性极高，不仅污染质谱设备，对操作人员也极具危险性；第二种预提取法经乙醇、甲酸、乙腈处理后能杀死部分病原体，但对于一些病原以及芽孢菌无法灭活，鉴定未知病原对仪器操作人员及环境存在危险性。另外，乙醇/甲酸法在点样前要经过加水、悬菌、加乙醇、离心、弃液、加甲酸、悬菌、加乙腈、离心、移液等一系列繁琐的过程，提取一个样本的至少要10min，生物安全风险高，且操作费时不简便。本领域迫切需要一种简便、快速同时又具备生物安全性的处理微生物样品的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种操作步骤简单、具备生物安全性的微生物质谱检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种具备生物安全性的、适用于 MALDI-TOF MS检测的微生物样品前处理方法。

本发明首先提供一种适用于MALDI-TOF MS检测的微生物样品前处理方法：

试剂A在样本制备套管上部的滤膜管中悬浮待测微生物样品，离心后样本制备套管下部的收集管中液体即为MALDI-TOF MS检测上样前微生物的蛋白样本，所述试剂A为50～90％甲酸和80～ 100％乙腈的等体积混合液。

离心条件均为8000～16000g，离心1～10min，优选离心条件为 13000g，离心5min。

上述方法中，微生物样品用量为0.5-5mg。

上述方法中，试剂A与待测微生物样本的体积质量比为 10～50ul：1mg，优选值为20ul：1mg。