[发明专利]一种利用ANP或IgANP基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用

权利要求书

1.一种表达ANP或分泌型ANP的重组腺病毒，其特征在于，其携带ANP或分泌型ANP基因，所述ANP 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述分泌型ANP 基因的核苷酸序列如SEQID NO：4所示；

构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pAdTrack-CMV；构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为pAdeasy-1；构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为人胚肾293A细胞；

其表达ANP或分泌型ANP，所述ANP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，分泌型ANP的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述表达ANP或分泌型ANP基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

1）proANP基因片段的获得：

a、细胞总RNA的提取；

b、cDNA的获得；

c、proANP基因扩增：proANP基因扩增体系所用的引物如下：

Sene：CGGGTACCCCATGAGCTCCTTCTCCACCACC；酶切位点：Kpn I；

Antisene：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；酶切位点：Xba I；

重叠PCR引物1：CTTCCAAATGGTCCAGCAAATTCTTGAAATCCATCAG GTCTGCG；

重叠PCR引物2：CGCAGACCTGATGGATTTCAAGAATTTGCTGGACCAT TTGGAAG；

2）ANP和IgANP基因片段的获得：

a、利用PCR反应从proANP片段中获取ANP基因，所用引物如下：

ANP sens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGAGCCTGCGGAGATCCAGC；酶切位点：EcoR I；

ANP anti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；酶切位点：Xba I；

b、重叠PCR反应获得IgANP基因：

首先，利用PCR反应合成可用于重叠PCR的Igκ信号肽基因，所用引物如下：

Igκ sens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGG；酶切位点：EcoR I；

Igκ anti序列：GCAGCTGGATCTCCGCAGGCTGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCC；

以及，利用PCR反应从proANP片段中获取可用于重叠PCR的SecANP基因，所用引物如下：

SecANP sens序列：AGCCTGCGGAGATCCAGC；

ANP anti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；

最后，以上述Igκ信号肽基因和ANP基因为模板，获得IgANP基因片段，所用引物为SecANP sens和Igκ anti；

3）pMD-20T-IgANP或pMD-20T-ANP载体的构建

IgANP或ANP与pMD-20T载体连接体系： pMD-20T载体、重叠IgANP或ANP分别被 Kpn I、Xba I双酶切回收产物，连接体系置于16℃恒温仪过夜；

4）pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP穿梭载体的构建：IgANP或ANP Kpn I、Xba I双酶切回收产物与Kpn I、Xba I双酶切Track载体连接；

5）pAd-IgANP或pAd-ANP 腺病毒骨架载体的构建：pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP质粒Pme I单酶切，取回收产物与pAd-easy-1质粒一起转化BJ5183感受态中，提取质粒即pAd-IgANP或pAd-ANP；

6）制备重组腺病毒Ad-IgANP或Ad-ANP：将提取的pAd-IgANP或pAd-ANP质粒，使用Pac I单酶切线性化后，使用Lipofectamine2000转染293-A细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因的表达，7天后可看到大量细胞漂浮,荧光开始减弱，此时先吸出一部分上清液转移到无菌的15mL的离心管中，剩余的培养基反复吹打皿底未漂浮的细胞，将其同培养基一起转移到离心管中；1000转，5min，离心收集上清液，即为包装后获得的重组腺病毒Ad-IgANP或Ad-ANP。

2.权利要求1所述的重组腺病毒在制备抑制舌癌细胞活性的药物中的应用。