[发明专利]一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

(2)取6μL、15～20μg/mL的氮掺杂碳量子点N-CQDs溶液滴到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；

(3)待电极近干时，滴加3μL、浓度为0.4～0.6mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC和0.2～0.25mol/LN-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液至电极表面，4℃冰箱中孵化30min，室温下晾干；

(4)滴加6μL、质量分数为0.5～2.0％的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；

滴加6μL、1～50ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；

(5)滴涂6μL、1～3mg/mL的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器。

2.如权利要求1所述的一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述氮掺杂碳量子点N-CQDs的制备步骤如下：

将0.2～0.3g的二乙基三胺五乙酸DTPA溶解于25～35mL的超纯水中，超声分散，继续加热至250℃下溶解，继续加热溶剂蒸发，出现白色固体，当白色固体变为棕黄色时表明氮掺杂碳量子点N-CQDs的生成；将所得的粗产品溶解在20mL超纯水中，9000rpmin离心，所得上层清液冷冻干燥得纯净的氮掺杂碳量子点N-CQDs固体，将其研磨成粉末，制得氮掺杂碳量子点N-CQDs。

3.如权利要求1所述的一种用于检测肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：

①磺化碳纳米管的制备

称取1.0～1.5g的多壁碳纳米管置于350mL三口烧瓶中，依次加入77mL浓硫酸和33mL浓硝酸，150℃油浴下反应50～55min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入1000mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于85～90℃真空干燥箱内干燥15～18h，得到磺化碳纳米管；

②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备

在250mL圆底烧瓶中依次加入12～16mg磺化碳纳米管，80mL、1.5mol/L的盐酸溶液，超声分散2h，加入2.0g4,4’-二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0℃，在搅拌下缓慢加入20mL亚硝酸钠水溶液，反应1.5h，升温至35℃，继续搅拌下反应2.5～3.5h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤4次，无水乙醇洗涤4次，得到的固体超声分散到80mL乙醇中，依次加入80mL乙腈和620mg三苯基磷，搅拌2h，用0.55μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤4次，所得固体90℃真空干燥箱内干燥15h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；

所述的亚硝酸钠水溶液是将300mg固体亚硝酸钠溶于15mL超纯水制得；

③银纳米粒子溶液的制备

将2mL、50mmol/L的硝酸银和2mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到50mL超纯水中，然后加入50～55mg硼氢化钠，在搅拌下反应20min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速6000rpm下离心10min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；

④银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备

取10～15mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到35～45mL银纳米粒子溶液中，130rpm转速下振荡12～15h，离心，90℃真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；

将4～8mg的银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到2mL超纯水中，加入200μL、100～110μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和1000μL、100mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化15h；在4℃下，8000rpm转速下离心20min，得到下层沉淀，加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入2mL、100mmol/L的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4℃下保存备用。