[发明专利]一种环形接头及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Ion Torrent二代测序平台的环形接头，以及该环形接头的应用，属于生物技术领域。

背景技术

目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。

新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion Torrent^TM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的快速发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用。

二代测序技术靶向测序同样具有巨大优势，由于测序的区域小，可以对某些区域进行深度测序，使得低频突变的检测率大大提高。肿瘤关键基因较多，适合使用二代测序对某些关键的基因进行深度测序，得到肿瘤致病突变信息及相关用药靶点信息。虽然高通量测序在肿瘤诊断方面应用前景广阔，但当下仍存在技术上的不足限制了其更为深入的应用，如：针对cfDNA的检测，其检测灵敏度有必要进一步提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够更稳定地实现高效、高灵敏度与低成本的二代文库构建，实验操作简单的环形接头，以及该环形接头的应用。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种环形接头，包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签、Ion接头A部分和互补序列区域的序列；所述互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。

上述Ion接头A部分和互补序列区域通过自身折叠互补的序列相间隔，所述互补序列区域中与Ion接头A部分互补的序列和与样本barcode互补的序列通过与正负链标签相同的序列相间隔。

上述任意碱基区域是12个随机碱基。

上述正负链标签为1个碱基。

上述样本barcode区域的碱基个数为8个。

上述Ion接头A部分的碱基个数为15个。

上述环形接头还包括设置在5’端的磷酸化修饰和公共序列，所述公共序列的碱基个数为13～16个。

上述环形接头的核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：上述环形接头用于I on Torrent二代测序平台中文库构建的应用。

本发明具有积极的效果：

(1)本发明的环形接头基于Ion Torrent二代测序平台，具有灵敏度高，特异性强，与样本DNA连接效率高，可以提高低频突变的灵敏度等特点，最低可以检测出样本DNA中0.01％的突变，满足了对cfDNA中极少量突变ctDNA检出的要求。

(2)本发明的环形接头是独特的闭环接头，包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的互补序列区域，相对于普通接头更稳定，连接效率更高。任意碱基区域有12个随机碱基，理论上能够产生4¹²种分子标签序列，以确保将每个源分子带上独一无二的分子标签，从而使建库和测序过程中引入的错误降到最低，提高检测突变的灵敏度。正负链标签为1个固定的碱基，相较于现有的多碱基随机正负链标签，有效的节约了测序读长并简化了对链标签的分析。样本barcode碱基序列为8个，能够识别不同样本的片段化产物。

(3)本发明的环形接头中包括单碱基链标签，可以根据该碱基区分DNA双链正义链和反义链，更进一步提高了其灵敏度。

(4)本发明的环形接头中5’端磷酸化有利于文库构建中与接头序列结合。

附图说明

图1是本发明实施例的环形接头的溶解曲线图。

具体实施方式