[发明专利]具有自适应采样帧率的动态超分辨荧光成像技术

说明书

具有自适应采样帧率的动态超分辨荧光成像技术。本发明涉及一种动态超分辨荧光显微图像的拍摄技术，包括：(1)一种荧光显微成像装置，能进行超分辨成像和低分辨成像，两种成像方式观察的视场区域、物平面相同；该装置能实时处理低分辨图像并反馈控制超分辨图像的采样帧率；(2)相应于装置的一种动态超分辨荧光显微图像拍摄方法，包括：以固定的高速采样帧率采集低分辨图像进行实时处理，采用计算光流的方式分析图像动态变化速率，将图像动态变化速率转换为超分辨图像的采集时间间隔，通过反馈回路实时控制超分辨图像的采样帧率，使之适应样品动态变化速率。本发明用于实现对样品快速动态变化过程的超分辨拍摄，并尽量延长对样品的拍摄时间。

技术领域

本发明涉及超分辨荧光成像技术领域，特别是涉及一种动态超分辨荧光显微图像的拍摄技术。

背景技术

传统荧光显微镜(如宽场照明、扫描共聚焦、全内反射照明等荧光显微镜)受限于阿贝衍射极限，其空间分辨率不能优于200nm，无法分辨更为精细的结构。近十几年来已经发展出了多种突破衍射极限的荧光成像方法，称为超分辨成像，如受激发射损耗成像(STED)、可逆饱和/开关光跃迁成像(RESOLFT)、光激活定位显微成像(PALM/FPALM)、随机光学重构显微成像(STORM)、结构照明显微成像(SIM、饱和结构照明SSIM、非线性结构照明NSIM)等；这些超分辨成像技术比传统荧光成像方法需要更高强度的激光照明(如STED、SSIM、NSIM等)，或者需要反复地开/关荧光分子(如RESOLFT、PALM/FPALM、STORM等)，严重加剧了对样品的荧光漂白和光毒性；因此，这些具有空间超分辨能力的成像方法应用于活细胞动态过程的成像时，能连续拍摄的图像帧数远少于传统荧光成像方法。

然而对于缓慢变化的图像，并不需要很高的采样帧率进行拍摄，便能观察到拍摄期间样品动态变化的完整过程；事实上，根据Nyquist采样定理，应该使拍摄时的采样帧率和图像的变化速率相匹配，这样既能够观察到拍摄期间样品动态变化的完整过程，又能够尽量延长拍摄时间，不至于因为高速的采样帧率而使荧光分子过早被漂白。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种动态超分辨荧光显微图像的拍摄技术，其目的是为了实现在超分辨成像的拍摄过程中实时地自动调节采样帧率，使其适应、匹配样品动态变化的速率。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种荧光显微成像装置，所述荧光显微成像装置从功能上划分为以下几部分：

样品台，用于承载被观测样品；

超分辨成像模块，该模块包括一系列光学元件、成像器件及光源，使用超分辨成像模块进行成像时，图像具有高空间分辨率，能突破阿贝衍射极限；

低分辨成像模块，该模块包括一系列光学元件、成像器件及光源，使用低分辨成像模块进行成像时，图像具有低空间分辨率，不能突破阿贝衍射极限；

控制模块，用于控制超分辨成像模块和低分辨成像模块进行拍摄，包括控制两个模块内的光源和光学元件；

图像记录和图像处理模块，用于记录图像并进行图像处理，分析图像动态变化速率；

反馈回路模块，连接控制模块与图像记录和图像处理模块，根据图像动态变化的速率输出自动调节采样帧率的信号。

所述超分辨成像模块和低分辨成像模块，两者成像时共用同一个显微物镜，并且所观察的视场区域相同、所观察的物平面在样品内的位置也相同；

所述超分辨成像模块和低分辨成像模块，低分辨成像时样品上的曝光剂量远弱于超分辨成像时样品上的曝光剂量，对样品所造成的荧光漂白和光毒性更小；

所述超分辨成像模块和低分辨成像模块，两者能够独立进行成像。

相应于所述荧光显微成像装置的一种动态超分辨荧光显微图像拍摄方法，其基本概念如下：