[发明专利]一种同步检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种同步检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR方法。

背景技术：

郁金香常用于花卉展览、盆栽观赏和鲜切花种植。因其植株整齐，色彩丰富，美观典雅，深受人们的喜爱。郁金香生产过程中极易受到软腐病危害。洋葱腐烂病菌(Burkholderia gladioli pv.alliicola)和菊基腐病菌(Erwinia chrysanthemi)是引起郁金香软腐病的重要细菌。这2种病原菌因其在国外发生分布广、定殖风险高、经济危害大，中国出入境机构已将其列为进境植物检疫性有害生物。近年来，随着经济的快速发展和人民生活水平的逐步提高，国内花卉消费正呈快速增长态势，郁金香花卉产业也在快速发展壮大，我国进口郁金香种球呈逐年增长态势。国外郁金香主产国多数是这2种病菌的疫区，因此这2种病菌随进口花卉传入我国的风险较大。目前，国内种苗指定口岸对细菌的检测多数仍采用传统的分离培养和生化鉴定方法，鉴定时间较长，影响快速通关。因而，建立快速实用、准确灵敏、操作简便的分子检测技术对控制病菌的传入具有重要意义。

目前，对这2种细菌的分子检测技术已有不少报道。国内外不少学者已初步建立了洋葱腐烂病菌的常规PCR检测方法。Lee等运用RFLP和PFGE方法分析了台湾的菊基腐病菌，Liu等设计了专化性引物，分子鉴定了菊基腐病菌。但是上述研究均只检测1种细菌，同步检测上述2种细菌的分子检测方法还未见报道。双重PCR技术可在1次反应中同时检测2种病菌，大幅节约检测时间，提高检测效率，降低检测成本。目前，该技术在植物病原物的检测应用中比较广泛。

发明内容：

本发明的目的在于提供一组用于同步检测洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR专用引物及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于同步检测洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR检测试剂盒。

本发明的又一目的在于提供一种同步检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一组用于同步检测洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR专用引物，该组引物由用于检测洋葱腐烂病菌的引物B3/B6和用于检测菊基腐病菌的引物ADE1/ADE2组成；

B3：TGGCGGTAGAAACCTGAGAG

B6：ACGACAGCCGATAAGCACACT

ADE1：GATCAGAAAGCCCGCAGCCAGAT

ADE2：CTGTGGCCGATCAGGATGGTTTTGTCGTGC。

所述引物B3/B6的扩增片段长度为208bp，所述引物ADE1/ADE2的扩增片段长度为420bp。

上述的双重PCR专用引物在制备用于同步检测洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR检测试剂盒中的应用及在同步检测洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌中的应用。

一种用于同步检测洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR检测试剂盒，该试剂盒中包含上述的双重PCR专用引物。

一种同步检测洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提权的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的双重PCR专用引物进行双重PCR；

(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测：扩增出长度为208bp的片段则判定为检测出洋葱腐烂病菌，扩增出长度为420bp的片段则判定为检测出菊基腐病菌。

作为一种优选技术方案，所述双重PCR的反应体系为：2倍Taq Master Mix 12.5μL，2对20μmol/L引物各0.3μL，基因组DNA模板0.5μL，补足双蒸水至25μL。

进一步优选的，所述基因组DNA模板的浓度≥1.0×10^-1ng/μL。

作为一种优选技术方案，所述双重PCR的反应程序为：94℃3min；94℃30s，66℃退火20s，72℃40s，30次循环；最后72℃延伸5min。

本发明的有益效果：