[发明专利]一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法

说明书

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，通过直接敲除枯草芽孢杆菌合成γ‑PGA的基因——pgs，包括将pgs‑F插入到pBTS质粒的KpnI和BamHI之间，将pgs‑R插入到BamHI和XhoI之间，构建新的质粒pBTS‑pgs，转化质粒进入待敲除菌株，进行第一次重组，以及进行第二次重组等步骤，获得不具有抗性标记的敲除pgs基因的菌株，阻碍芽孢杆菌合成γ‑PGA，进而降低发酵液的粘度，促进菌体生长，提高发酵产物浓度。

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法。

背景技术

在一些芽孢杆菌的生长过程中，聚γ-谷氨酸（γ-PGA）从细胞壁中分泌出来形成菌体的荚膜结构，也可溶解在发酵液中。发酵液当气、固含量以及气、固微粒分散到一定临界值时，就发生连续的流动相和气、固分散相的突变，表现在发酵液非牛顿性的变化，显示粘度上升。

γ-PGA属于高分子聚合物，聚合度约在1,000-15,000之间。由于γ-PGA中谷氨酸残基上的亲水基团存在，可通过氢键结合大量水，增加分子体积，进而导致发酵液变得异常粘稠。粘度增加，首先会影响通风供养，增加搅拌阻力，影响菌体生长；也会提高表面张力，影响泡沫破碎，进而在发酵过程中产生不可控制的泡沫，导致发酵失败或者目的蛋白表达量下降。

一般通过对培养基优化或者发酵控制来降低γ-PGA分泌的方法，比如专利CN201410174064.3，说明书中公布在发酵初期在液态发酵培养基中添加质量体积浓度为0.5-30g/L的KCl，在保持高分子量高产量γ-聚谷氨酸的基础上，将粘度降为原来的10-80％，这些方法虽然取得了一些效果，但只能降低γ-PGA的分泌量，并不能完全清除γ-PGA，并且重复性不好，也不具有通用性。

专利CN200810117844.9，说明书中公布了在具有荚膜的克雷伯氏属菌株中，通过在启动子后ORF3的部分序列后整合终止子，阻断克雷伯氏菌荚膜形成，降低其发酵液粘度，降低PDO产物分离提取难度，同时降低了菌体的致病性。但这专利中方法会存在着没有敲除抗性标记，不能继续对菌株进行改造或者转入质粒技术问题，重复性和通用性不高。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，敲除合成pgs的基因，阻碍γ-PGA合成，进而降低发酵液粘度，具有非常高的重复性和通用性。

解决以上技术问题的本发明中的一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，其特征在于：通过直接敲除枯草芽孢杆菌合成γ-PGA的基因——pgs，阻碍芽孢杆菌合成γ-PGA，进而降低发酵液的粘度，促进菌体生长，提高发酵产物浓度。

所述降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，包括以下步骤：

（1）抽提待改造菌株的DNA，通过引物扩增pgs基因的上游片段pgs-F和下游片段pgs-R；

采用Toyobo的KOD -Plus- Neo酶进行扩增，扩增条件程序： 94℃,2min; (94℃，30s；60℃，30s；68℃，1min) x25；72℃，2min。

（2）通过酶切，将pgs-F插入到pBTS质粒的KpnI和BamHI之间，将pgs-R插入到BamHI和XhoI之间，敲除pgs基因，构建新的质粒pBTS-pgs；

(3)通过电转化将pBTS-pgs转入待改造的芽孢杆菌中，得阳性转化菌株；

(4)挑取（3）中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间大于24h；

(5)取步骤（4）中菌液100ul—500ul，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB平板上，培养温度为45℃，进行过夜培养；

（6）挑取步骤（5）中的菌落进入液体培养基中进行培养，每8—16h传代一次，直到筛选到无抗菌株；