[发明专利]一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法

权利要求书

1.一种基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品前处理：准确称取烟叶样品粉末于离心管中，依次加入甲醇、甲基叔丁基醚、水作为提取剂，其中所述的甲醇：甲基叔丁基醚：水的体积比为30~40:40~50:65~75，超声，离心，取下层清液，加入内标溶液，离心浓缩去掉溶剂，加入乙腈复溶，复溶液转入液相色谱进样小瓶，待分析；所述的内标溶液为100ng/mL的磷酸三苯酯的乙腈溶液；

2）标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，配置10μg/mL 的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液，然后分别移取5、10、20、40、80、150μL 标准混合溶液至离心管，再分别称取不含马来酰肼及其糖苷的烟叶样品粉末至离心管作为样品基质，当所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末时，称取量为10mg；当所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末时，称取量为100mg；制成不同浓度梯度的待测样本，离心浓缩，除去样品中的甲醇溶剂；然后按照步骤1）中所述的样品前处理进行处理，再转至液相色谱-串联质谱进行分析，得到每个浓度梯度样本对应的色谱质谱相对内标的峰面积；将得到的相对峰面积和其对应的浓度梯度进行线性拟合，得到校准曲线方程和线性相关系数；

3）样品分析：将步骤1）处理后的待分析样品进行液相色谱-串联质谱分析，将得到的马来酰肼及其糖苷的色谱质谱峰相对面积输入校准曲线方程，计算得到相对应的物质浓度；

步骤2）和3）中所述的色谱分析条件为：色谱柱为100mm×2.1mm×1.7μm 的WatersACQUITY UPLC@BEH HILIC，A相洗脱溶剂为0.2%甲酸的水溶液，B相洗脱溶剂为0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件为2% A相保持1.00min，1.00-4.30min A相比例升至12%，4.30-4.31min A相比例升至50%，4.31-6.00 min，A相比例保持为50%，6.00-6.01minA相比例变为2%，6.01-7.00min A相比例保持为2%；流动相流速为0.3mL/min；柱温23℃；进样量5μL。

2.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的烟叶样品粉末为新鲜烟叶样品粉末，每100mg新鲜烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的新鲜烟叶样品粉末的制备方法为：将新鲜的烟叶样品在液氮冷冻下研磨粉碎至小于40目，磨好样品迅速转入离心管封存于-80℃冰箱，备用。

3.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于所述的烟叶样品粉末为烤后烟叶样品粉末，每10mg烤后烟叶样品粉末共加入1500μL提取剂，所述的烤后烟叶样品粉末的制备方法为：将烤后烟叶样品研磨粉碎至小于40目，磨好样品转入离心管封存于4 ℃冰箱，备用。

4.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤1）中所述的甲醇-甲基叔丁基醚-水的体积比为37:45:68。

5.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤1）中所述的超声的时间为25~35min，离心的时间为3~7min，离心力≥5000g。

6.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤1）中所述的内标溶液与下层清液的体积比为1:60。

7.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤2）中所述的马来酰肼及其糖苷的混合标准溶液为马来酰肼、马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷及马来酰肼-N-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液或马来酰肼及马来酰肼-O-β-D-葡萄糖苷的混合标准溶液中的任一种。

8.根据权利要求1所述的基于液相色谱-串联质谱的烟叶马来酰肼及其糖苷的定量分析方法，其特征在于步骤2）和3）中所述的质谱条件为采用正离子模式多反应离子检测模式MRM采集数据，离子源条件采用分段设计，具体如下：

液相保留时间0-3.2min：喷雾电压4000V；气帘气25psi；碰撞气9psi；温度700℃；离子源气体1，40psi；离子源气体2，90psi；去簇电压60V；入口电压10V；碰撞池外部电压15V；液相保留时间3.2-7.0min：喷雾电压5500V；气帘气25psi；碰撞气5psi；温度250℃；离子源气体1，40psi；离子源气体1，60psi；去簇电压60V；入口电压10V；碰撞池外部电压15V。